牛出血性败血症胶体金免疫层析快速诊断方法的建立

刘 凯，刘忠清，李文德

（1.西藏职业技术学院，西藏拉萨850030；2.西藏出入境检验检疫局，西藏拉萨850001）

牛出血性败血症（Bovine haemorrhagic septicaemia），临床上简称为“牛出败”，是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）引起的主要以高热、肺炎、急性胃肠炎以及内脏广泛性出血为特征的急性、热性传染病。该病呈地方性流行或散发，水牛、耗牛、绵羊有时呈地方性流行，常局限于一定的地区，我国各地都有发病报道，其中西藏发病率和病死率都很高，牦牛病死率在30%以上，幼畜病死率在80%以上。发病季节不明显，但以冷热交替、气候骤变、湿热多雨时多发。该病的致病菌存在于病畜的全身各组织、体液、分泌物及排泄物中，主要经口或呼吸道（飞沫）感染。耐过动物可成为带菌动物，是本病的传染源之一。健康牛只主要通过与病牛直接接触或通过被本菌污染的垫草、饲料、饮水而感染。本病的发生与环境、机体的状态、病菌的血清型及毒力等都有着密切关系。寒冷、闷热、潮湿拥挤、通风不良、疲劳运输、突然更换饲料或营养缺乏等不良因素均可诱发本病。

目前，对牛出血性败血症的诊断主要根据流行特点、临床症状和剖检变化做出初步诊断，确诊需要进行细菌学检查和小鼠感染验证等方法。在这些方法中，流行特点、临床症状和剖检存在的缺点是需要收集的资料多、工作复杂繁重、易造成污染，诊断误差大，还难以与炭疽、气肿疽、恶性水肿、牛肺疫等病相区别。而细菌学检查和小鼠感染验证方法除了工作复杂繁重外，还需要具备一定的仪器设备和条件，且所需时间长，在我区基层畜牧兽医部门难以开展。免疫层析技术是近年来发展的一种快速检测技术，虽然它的敏感性和特异性均不如PCR和ELISA高，但是，它具有不需要仪器、检测快速、操作简单、适合现场检查等优点，在传染病的快速诊断方面显示出很好的应用前景，非常适合于基层兽医和相关技术人员、农牧民群众对动物疾病的诊断。因此，结合相关技术，我们开展了牛出血性败血症胶体金免疫层析快速诊断方法的研究探索。

1 材料与方法

1.1 材料

多杀性巴氏杆菌由西藏自治区生物制药厂提供；牛副结核病、炭疽病、牛结核、口蹄疫阳性血清为中国兽医药品监察所生产。样本病料由西藏职业技术学院采自经细菌学检验均为阳性牛出血性败血症的西藏那区、拉萨牦牛养殖户病牛，并保存；牛出血性败血症抗体由西藏职业技术学院制备，由上海杰一生物技术有限公司纯化。

主要试剂为西藏大地仪器设备公司和上海精闵商贸有限公司产品；硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、样品垫、吸收垫均为上海杰一生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 抗体的制备与纯化 将多杀性巴氏杆菌接种在全血马丁琼脂平板培养基中，37℃培养20 h～24 h，用灭菌生理盐水洗下培养菌后计数，然后用灭菌生理盐水将菌液稀释至2×1014个细菌／L。加入50 mL／L的甲醛灭活24 h，灭活期间振荡数次，灭活后菌液经细菌检验没有活性后4℃保存。并用其液同时同剂量免疫A、B两只青年雄性家兔，每隔5 d免疫1次，共免疫5次，每次剂量分别为1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，肌肉多点注射，最后1次免疫后7 d经测试合格后分别从颈动脉放血，分离血清，分别采用辛酸－硫酸铵法粗提、H－i Trap Protein GHP亲和层析法纯化，用紫外分光光度计测定提纯抗体的浓度并调整至1 mg／mL，分装并命名为名为兔抗巴氏杆菌IgG－A和兔抗巴氏杆菌Ig G－B，置－20℃冷冻保存备用。

1.2.2 胶体金溶液的制备 取300 mL洁净硅化三角瓶一个，向内加99 mL去离子双蒸水和1 mL 10 mL／L氯金酸，加热煮沸，在磁力搅拌下快速准确加入10 g／L柠檬酸三钠1.5 mL，煮沸至溶液变为橙红色，继续煮沸15 min，冷却后用去离子双蒸水恢复到原体积，最后置于洁净的棕色瓶中4℃ 冰箱保存备用。

1.2.3 抗体与胶体金结合的最佳p H确定 取若干个1.5 mL离心管，分别加入1 mL上述制备的胶体金溶液，用0.2 mol／L K2CO3将p H分别调为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。取50μL 1 mg／mL 的兔抗巴氏杆菌IgG－A加入上述胶体金管中，震荡20 min后室温放置10 min，然后每管分别加入100μL 100 g／L NaCl溶液，继续震荡混合10 min后室温下放置10 min；观察胶体金溶液颜色变化，记录保持红色的最低p H（X）。再按上述方法将p H调为梯度为X－1.0；X－0.8；X－0.6；X－0.4；X－0.2；X；X＋0.2；X＋0.4；X＋0.6；X＋0.8；X＋1.0；X＋1.2重复上述试验。记录仍保持红色的最低p H，即为最佳p H。

1.2.4 抗体与胶体金结合的最佳浓度确定 首先取若干个1.5 mL离心管，分别加入抗体与胶体金结合的最佳p H的胶体金溶液1 mL，然后各管依次分别加入梯度为其浓度达到每毫升中含有抗体1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg的兔抗巴氏杆菌IgG－A，震荡混合20 min后室温下放置10 min，然后每管分别加入100μL 100 g／L NaCl溶液，继续震荡混合10 min后室温下放置10 min。颜色仍保持红色的最小抗体用量即为抗体与胶体金结合的最佳浓度。

1.2.5 免疫胶体金溶液的制备 取一个20 mL的洁净试管，加入需制备量的胶体金溶液，0.2 mol／L K2CO3将p H调整为抗体与胶体金结合的最佳p H值，根据抗体与胶体金结合的最佳浓度和要标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量，逐滴加入兔抗巴氏杆菌IgG－A于胶体金溶液中，摇匀15 min，室温放置10 min～15 min，加入100 mL／L BSA 至终浓度为50 mL／L，再继续搅拌15 min，防止抗体蛋白和胶体金聚合和沉淀，最后置于4℃ 冰箱保存备用。

1.2.6 免疫层析检测条的制备 试纸条由下至上依次由样品垫、金标抗体结合垫、NC膜和吸水垫4个部分组成，具体组装过程如下：将兔抗巴氏杆菌IgG－A胶体金溶液喷在玻璃纤维膜上，将兔抗巴氏杆菌IgG－B和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维膜检测线（T）区和对照线（C）区的相应位置上，冷冰风干备用，把试纸条各组分按顺序分别贴附在黏性PVC底板的相应位置上：样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、吸水纸，然后切割成4 mm宽的纸条，装入一个特制的塑料卡内，放入铝箔袋内，再装入干燥剂后密封，置于4℃ 冰箱保存备用。

1.2.7 试纸条的临床检测

1.2.7.1 用法 撕开铝箔袋，将试纸条检测卡平放，取待检液1～2滴加入到加样孔内，在室温内静置5 min～10 min后观察结果。

1.2.7.2 结果判定 检测线（T）和区对照线（C）各出现一条颜色较深的在紫红色线为阳性；在检测线（T）处出现一条颜色很浅的紫红色线，而对照线（C）出现一条紫红色线判为弱阳性；检测线（T）处不出现色线，对照线（C）出现一条紫红色线判为阴性；在对照线（C）不出现色线的均为失效。

2 结果

2.1 胶体金溶液的制备

用上述方法制备的胶体金溶液，经紫外分光光度计检测，得知胶体金颗粒直径约为30 nm。

2.2 抗体与胶体金结合的最佳p H确定

用上述方法得出的最佳p H为8.8。

2.3 抗体与胶体金结合的最佳浓度确定

用上述方法测得颜色仍保持红色的最小抗体用量为30μg／mL。即为抗体与胶体金结合的最佳浓度是30μg／mL。

2.4 特异性试验

用上述条件制备的牛出血性败血症胶体金免疫层试纸条，检测10例阳性牛出血性败血症病料，结果均显示阳性反应。而用同样试纸条同时对牛副结核病、炭疽病、牛结核、口蹄疫阳性抗原分别检测，结果均为阴性，显示均无交叉反应。且都在5 min～10 min内显示结果。

2.5 稳定性试验

将制备的牛出血性败血症胶体金免疫层试纸条分别放置4℃冰箱和37℃培养箱中，每隔10 d各取5条，分别检测阳性牛出血性败血症病料和牛副结核病、炭疽病、牛结核、口蹄疫阳性任一种抗原，共检查2月，结果无异常变化。

2.6 试纸条的临床检测

在临床实践中，对细菌检查为阳性的59例牛出血性败血症病料用制备的牛出血性败血症胶体金免疫层试纸条进行检测，均在5 min～10 min内显示为阳性结果。对147头健康牛检测均为阴性，符合率达到100%。说明试纸条具有细菌检测同样的效果。

3 讨论

在制备胶体金溶液、确定试验抗体与胶体金结合的最佳p H和抗体与胶体金结合的最佳浓度时，要严格按照技术操作规程进行；在试纸条喷涂和组装过程中，环境湿度不应超过40%，否则制备的试纸条容易失效。

以胶体金免疫层技术在牛出血性败血症定性诊断上还是首次尝试，目前国内外尚未见报道，而以抗原为诊断目标的检查动物疾病的报道也很少。用本文方法建立的牛出血性败血症胶体金免疫层试纸条，检测样本用量少，只需不到1 mL就可以了，同时检测方法简单、快速、特异性和稳定性强，只需5 min～10 min就可用肉眼观察并判断结果，不需专业的人员及特殊的设备，检测费用低。因此，特别适合基层兽医和动物检疫工作人员、基层养殖户等人员进行现场检测或诊断。所以，该技术具有广阔的市场和应用前景。

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