禽滑液囊支原体研究进展

曹中赞，栾新红，刘胜旺，何剑斌

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）

支原体（Mycoplasma）也称霉形体，是一类没有细胞壁的原核生物，属于软膜体纲，霉形体目霉形体科。鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）和滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）是两种重要的家禽病原。MS能够感染鸡和火鸡，引起上呼吸道疾病、传染性滑膜炎和黏液囊炎的发生，降低产蛋量、蛋品质以及孵化率，导致生长迟缓和饲料转化率降低，降低屠宰时胴体质量，使屠体废弃率升高［1］，给全球家禽工业带来严重的经济损失。本文就目前MS的流行情况、致病机制、诊断方法以及防控措施等方面的研究进展进行了概述，以期更好地检测、诊断、净化和防控禽滑液囊支原体病。

1 滑液囊支原体流行病学概况

MS一年四季均可发生，但冬春季节易发。各种日龄鸡只均易感，尤以雏鸡最为严重。禽对MS感染的抵抗力随年龄的增长而加强。病禽和隐性感染禽是本病的传染源。可以经种蛋垂直传播，也可通过人员、野鸟、饮水、垫料等进行直接或间接的水平传播。饲养管理水平差，生物安全措施不完善，不良环境因素是导致MS感染流行的主要因素。

MS感染能够给商品肉鸡带来全身性的损伤，包括黏液囊、肝、脾、脑、眼膜和骨骼肌等，引起气囊炎和上呼吸道疾病，以及关节炎和传染性滑膜炎的发生，导致屠宰时胴体废弃率上升，甚至会激发免疫系统的抑制［2］。MS感染能够使产蛋鸡群的产蛋量和产蛋品质受到损失。Gole V C等［3］应用 ELISA检测蛋黄抗体的方法对随机挑选的19个澳大利亚商品蛋鸡群进行流行病学调查，MS抗体阳性率高达69%，统计学分析表明MS血清学状态和一些蛋品质参数如透明度、蛋壳破裂强度、蛋壳反射率和畸形率有一定的相关性。Feberwee A 等［4－5］研 究 表明，MS感染能够使商品蛋鸡群和肉种鸡群的产蛋率降 低、蛋 壳 尖 端 缺 陷 （eggshell apex abnormalities，EAA）发生率升高。这种影响在意大利的产蛋鸡群中也被监测到［6］。

MS在种用鸡群和商品代鸡群的流行情况不同。多个国家的流行病学监测表明MS在商品代鸡群中有很高的流行率。Hagan等在英国随机检测了56个农场的卵黄抗体样品，有78.6%的农场抗体阳性。Dufour－Gesbert F等［7］从超过60日龄的法国某蛋鸡群里分离培养了53份样品，其中有36份是MS阳性（68%）。Xavier J等［8］对阿根廷2003年1月至5月、2004年12月至2005年4月两个时期的庭院养鸡的2 441份血清样品进行了MS血清流行病学监测，结果发现这两个时期的MS血清抗体阳性率分别为68.6%和100%。而祖代和父母代种鸡场情况则不同，Feberwee A等［9］在2005年至2006年对荷兰一些商业鸡场进行了12个月MS血清流行病学调查，结果发现蛋鸡和肉鸡的祖代鸡群MS血清阳性率分别为0和10%，蛋鸡和肉鸡的父母代鸡群阳性率分别为25%和35%，商品蛋鸡群和商品肉鸡群的阳性率分别为50%和73%。由此可以看出，祖代和父母代种鸡场由于有着高水平生物安全措施的实施，以及严格的接触传播控制和地理区域隔离，使得MS的血清阳性率低于商品代鸡群。

MS目前在我国还没有广泛的流行病学数据，但已有从河南、陕西、北京、广东、广西、呼和浩特和上海等地区分离到 MS的报道［10］。血清学调查表明国内多个地区鸡群中存在MS感染［11］。

2 滑液囊支原体致病机理

支原体是最小的自我复制的微生物，有着非常小的基因组和蛋白质组。支原体与宿主的相互作用主要反映在膜蛋白上，膜蛋白负责黏附宿主细胞，而且是宿主免疫应答的主要目标。在MS方面研究较多的膜蛋白是可变脂蛋白及血凝素蛋白（variable lipoprotein haemagglutinin，Vlh A）［12］。Vlh A 蛋白在介导黏附宿主细胞以及免疫逃避方面扮演重要角色。Vlh A蛋白经过翻译后切割产生氨基端部分（脂蛋白 MSPB）和羧基端部分（MSPA）。MSPA和MSPB都是表面暴露蛋白，具有高频率的抗原变异性［13］。5′Vlh A基因区编码富含脯氨酸的重复区，在不同MS株之间是高度多态性的，这个区域的插入和缺失能导致不同MS株的MSPB长度发生变化，此外，5′Vlh A基因区和基因组假基因的重组能导致MSPB羧基端2／3区，以及MSPA中的抗原决定簇发生改变，在不同MS株的MSPA蛋白上有着明显的抗原差异［14］。迄今为止，只有MSPA被发现在介导黏附宿主细胞、以及MS感染的发病机理方面有着重要作用。而富含脯氨酸多肽具有免疫调节和加强抗体应答的效果，推测MSPB可能诱导强烈的免疫应答，在MS免疫逃避中有着一定作用［15］。

MS通过MSPA与宿主黏膜表面的受体相结合是其感染宿主细胞的第一步，由于MS简化的基因组和有限的生物合成能力，需要从宿主那里获得胆固醇、氨基酸、脂肪酸、维生素、核酸等其他营养物质，进而生长繁殖，这一过程可能引起宿主细胞损伤。而MS细胞内所含的各种外毒素或内毒素，如神经氨酸酶、过氧化氢酶、卵磷脂酶等酶类以及其自身自然代谢产物，可引起宿主细胞损伤或死亡。

3 MS诊断方法

控制和清除支原体依赖于准确及时地对感染群体做出诊断。高度敏感、准确、快速的诊断方法对MS的监测，最终建立无MS感染禽群是必须的。MS的诊断方法包括病原的培养和分离鉴定、血清学诊断以及分子生物学方法。

3.1 病原培养分离

支原体培养和分离鉴定作为准确诊断的“金标准”，是最可靠最经典的诊断方法，常用来进行血清学阳性样本的确认。但存在劳动量大、浪费时间的缺点。尤其在多种支原体以及其他细菌混合感染的情况下，它们的分离培养是非常费时和有难度，而且阳性结果的获得，通常需要4 d～7 d，甚至30 d。

3.2 血清学检测方法

最常用的血清学检测方法包括血清平板凝聚试验（serum plate agglutination，SPA），血凝抑制试验（hemagglutination inhibition，HI），以及酶联免疫吸附 试 验 （enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）。血清平板凝聚试验主要是检测血清中的Ig M抗体，Ig M一般是感染后3 d～5 d出现，持续70 d～80 d［8］。该技术快速，方便，在生产上应用较多，但由于禽群灭活疫苗的使用、污染的血清以及交叉反应，该方法容易出现假阳性结果。血凝抑制试验是一种操作简易的血清学技术，主要检测血清中Ig G抗体，具有特异、准确的优点，但敏感性差。IgG抗体一般在感染后10 d才出现，该方法不适用于MS感染的早期诊断。此外，该法耗时较长，在生产实践中的推广应用受到一定限制。MS和MG（Mycoplasma gallisepticum）在血凝抑制试验中没有交叉反应，这有助于 MG和MS感染的区分。ELISA做为世界动物卫生组织（OIE）检疫规范收录的MS检测技术，是一种快速敏感的血清免疫学诊断技术，为大量样本的检测提供了技术平台。该技术除可用于检测MS感染鸡血清中的抗体水平，还可用于蛋黄中抗体的检测。蛋黄样本的检测避免了血清样本的昂贵，血样采集对宿主造成的应激，人员的培训等弊端。Hagan J C 等［16］对蛋黄样本的ELISA检测技术进行了评估，认为用氯仿提取卵黄抗体进行ELISA检测是适合产蛋鸡群MS监测的一种有效方法。为解决ELISA用于MS检测特异性不强的问题，多位学者对用于ELISA的包被抗原进行了研究，早期用于检测抗体的MS抗原多是一些粗制的、难以确定的膜组份，后来Noormohammad A H 等［17］用 MS代表株 WVU 1853的重组脂蛋白（r MSPB）作为包被抗原，建立了检测不同株MS抗体的间接ELISA方法，增强了敏感性和特异性。

随着技术的发展一些先进的的血清免疫学方法不断被研制出来，Oh K等［18］用 MSPA作为抗原，基于表面等离子体共振成像（SPRi）的蛋白质芯片技术来检测鸡血清中的MS抗体，这种不用标记的高通量方法比ELSIA更可靠，更节省时间。但是，世界卫生组织仅把血清学检测方法推荐为在群体中进行禽支原体筛选监测的工具，而不是个体诊断的工具。这是因为这些血清学检测方法有着不同的特异性和敏感性。Feberwee A等［9］研究指出不应该只依赖于某一种检测方法，因为这些检测方法存在着不同程度的假阳性结果。Luciano R L等［19］观察到SPA、HI和ELSIA三种血清学检测方法一致性不显著，建议阳性结果应该用传统的微生物学病原分离和鉴定方法以及分子生物学方法进行确定。

3.3 分子生物学方法

传统的实验室病原分离培养及血清免疫学检测方法耗时长、费用昂贵，在快速诊断方面存在一定弊端，而且，由于血清学检测方法是针对抗体进行检测的技术，与MG存在明显的交叉反应性，所以，这两种技术均不能满足对MS进行快速确诊的要求。随着分子生物学的发展，一些用于检测MS的分子生物学方法相继被建立起来。最早是用特异性的重组DNA探针来检测MS，它们的敏感性是1 ng～2 ng靶DNA分子，相当于大约106个菌落，但这样大小的菌落数可能仅出现在急性感染的情况下。为了继续提高检测方法的敏感性和特异性，有学者根据MS的16 SrRNA序列设计引物对MS进行PCR检测，与病原培养分离以及血清学方法相比较，这种方法提高了检测的敏感性和特异性。但是，由于死亡细胞的DNA也能够用PCR方法扩增出来，因此，PCR检测结果和细菌细胞的活性以及感染性没有直接关系。鉴于支原体的r RNA没有DNA稳定，基于MS的16 SrRNA的RT－PCR检测方法被建立起来，可以用来检测有活性的或者最近死亡的（23 h之内）MS细胞。

MS和MG存在着一定程度上的抗原相似性，用传统的血清学检测方法很难把它们区分开来。而基于16 SrRNA设计引物的PCR方法，由于相似性高达78%，还需要限制性酶切片段分析和特异性探针杂交方法进行验证。而且这些方法会伴随着其他非相关细菌DNA的扩增。因此，基于支原体血凝素蛋白基因的PCR检测方法相继被建立起来。Hong Y等［20］根据 MS的vlh A基因建立了真对不同来源的商业鸡场MS田间分离株进行检测和分型PCR方法。MS和MG在临床上常出现混合感染，对其进行快速鉴别诊断是净化和尽快采取防控措施的前提。Mardassi B B等［21］针对编码 MG 血凝素蛋白基因p MGA1.2和MS的vlh A基因保守区设计引物，建立了多重套式PCR检测方法，可以非常敏感和特异性的同时检测这两种重要的禽类支原体。与常规PCR技术相比，多重PCR简化了检测程序，特别是在临床症状不典型、多种疾病混合感染的情况下，大大提高鉴别诊断的速度，节约生物试剂和人力资源。

此外，传统的PCR检测方法需要标准的凝胶电泳分析，增加了由于扩增子携带污染导致的假阳性风险。实时荧光定量PCR（Real－time PCR）比普通PCR更敏感、更快速，而且不需要扩增后的凝胶电泳分析。Jarquin R等［22］基于 MG和 MS的16 SrRNA设计引物，建立了Real－time SYBR green PCR分析方法，可以在同一反应中检测MG和MS，减少对霉形体暴发做出准确诊断的时间。Sprygin基于MG的mgc2基因和MS的vlh A基因，用Taq Man标记的探针作为内参照避免了假阴性结果，建立了高度敏感性、特异性并且重复性好的多重Real－time Taq Man PCR分析方法，能够同时检测MG和MS，不仅可以用于商业鸡群和火鸡群，而且可以用于鸭和鹅的检测［23］。

3.4 其他诊断方法

由于一些国家和地区使用致弱的MS活疫苗免疫鸡群，疫苗株和田间分离株的鉴别对流行病学跟踪是非常有意义的。基于这种目的，MS限制性内切酶多型性分析（RFLP）被建立起来。但RFLP需要病原分离培养，提取基因组DNA，比较浪费时间，尤其是一些单一MS分离株的后代，可能会发生基因组重排，导致结果不可信。为此，一些研究者通过对MS vlh A基因的单拷贝保守区进行测序，进行MS分型和流行病学调查［20］。此外，Jeffery N 等［24］建立了针对MS vlh A基因的以PCR基础的单链构象多态性和熔解曲线分析技术，为检测和鉴别MS株提供了高分辨率突变检测工具。

4 防控措施

良好的饲养管理和健全的生物安全措施是控制禽支原形体病的基础。此外，还要加强祖代和父母代种鸡群MS的流行病学检测，致力于无支原体感染种鸡群的培育。

药物治疗是防治禽支原体感染的一种常用方法，方便、快捷，能及时减轻已发病鸡群的症状。但不同菌株对抗生素敏感性存在差异，最好对本场分离的支原体做药敏试验，选用高敏药物进行治疗。Landman W J等［25］体外研究表明17种 MS荷兰本地分离株以及典型株WVU 1853均对强力霉素、泰乐菌素和替米考星敏感。

随着MS耐药菌株的不断出现，以及禽产品的药物残留，药物治疗在生产上的应用越来越受到限制。人们探讨用疫苗接种来防制家禽支原体病，但支原体的培养条件比较苛刻，疫苗的制造成本比较高。目前仅在澳大利亚等国家有商品化的MS灭活疫苗和弱毒疫苗应用［26］。相信随着分子生物学技术的发展，一些新型疫苗会被开发出来。

5 展望

综上所述，随着越来越多关于家禽滑液囊支原体病原学、流行病学和感染致病机理等知识的积累，一些快速、敏感和准确的检测和诊断方法将会被陆续建立，一些新型疫苗将会被相继开发，同时也会筛选到一些更高效的治疗药物。支原体自身的变异特性、免疫逃逸功能决定了禽支原体病比急性、烈性传染病更加难于控制，防控禽支原体病会是一项长期动态、细致复杂的工作，要严格做好种用禽群的支原体净化工作，建立无支原体感染种禽群，通过环境控制、有效疫苗免疫和敏感药物程序性用药，控制禽支原体病。

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