优化高效液相色谱法测定棉籽粕中游离棉酚的含量

陈 来 冷向军 李小勤＊ 王晓芳 李乃顺 周璐颖章樟红 董 晰 姚劲挺 柴仙琦

饲料蛋白资源的紧缺，使得棉籽粕越来越多地应用于饲料工业。棉籽粕中含有大量抗营养因子，特别是游离棉酚，成为限制棉籽粕在饲料中大量应用的主要因素。棉酚是一种多酚羟基联萘醛类化合物，按其存在形式，可分为游离棉酚和结合棉酚。游离棉酚的活性基团（羟基和醛基）对动物有一定的毒性，主要表现为影响饲料适口性，抑制动物生长，损害雄性动物生殖系统发育［1－2］；结合棉酚是游离棉酚与氨基酸等化合物结合而成，其毒性较小。为控制动物对游离棉酚的摄入量，《饲料卫生标准》（GB 13078—2001）［3］和《无公害食品渔用配合饲料安全限量》（NY 5070—2002）［4］规定了棉籽饼（粕）及肉用仔鸡、生长鸡、产蛋鸡、生长肥育猪、温水杂食性鱼类、虾类配合饲料中的游离棉酚的含量。

为合理地利用棉籽粕，对棉籽粕中的游离棉酚含量进行准确测定尤为重要。目前，检测游离棉 酚 的 方 法 有 分 光 光 度 计 法［5－6］、薄 层 层 析法［7－8］、高 效 液 相 色 谱 （high－perfor mance liquid chro matography，HPLC）法［9－13］等。分光光度计法包括苯胺法和间苯三酚法，其中苯胺法是国家标准《饲料中游离棉酚的测定方法》（GB 13086—91）中采用的方法，这2种方法选择性不强，与游离棉酚有相似化学结构的物质均能被同时检出，使得检测结果偏高，并且操作繁琐，使用的苯胺等溶剂具有毒性；薄层层析法也具有样品分离度低、准确度低、溶剂毒性较强、操作繁琐等不足；HPLC法则具有分离效率高、灵敏度高、准确性高、简便快速、可自动化检测等优点，具有广泛的应用前景。但是本实验室在前期研究中发现，以95%乙醇－水－乙醚－冰醋酸（体积比为71.5∶28.5∶20∶0.02）为溶剂和提取剂时，提取不彻底，样品在溶剂中稳定性差［9］；以丙酮为溶剂时，稳定性好，但目的峰形不佳，出现前延峰，这些均影响了测定的准确度、精密度和灵敏度［10］。因此，本试验拟从溶剂、提取剂、提取工艺、色谱条件优化等出发，筛选并建立最佳的样品处理方法和色谱条件，建立快速准确的测定棉籽粕游离棉酚的HPLC方法，为棉籽粕的合理利用提供科学依据。

（2）完善科研经费审计报告。内部审计人员应运用专业技能对科研经费的开支情况进行评价，将科研经费管理的具体情况、发现的问题以及处理建议汇报给单位负责人。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：LC－20 A高效液相色谱仪（日本岛津国际贸易有限公司）、DU－800紫外扫描仪（Beconman）、SK－2210 HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）、2 XZ（S）－Z型旋片式真空泵（上海德英真空照明设备有限公司）、HNY－200B恒温摇床（天津市欧诺仪器仪表有限公司）、5810 R离心 机 （Eppendof）、RV10 旋 转 蒸 发 仪 （IKA）、CPA－2250电子分析天平（Sartorius）、H－101振荡器（上海康禾光电仪器有限公司）。

在使用TDR系统进行滑坡的长期监测过程中，首先根据滑坡的实际情况，在滑坡的某个位置钻孔，打穿潜在滑动面后直至稳定的地层，将TDR同轴电缆安放在监测钻孔中。而后，将同轴电缆与电缆测试仪相连，回填钻孔，将同轴电缆与周围地层紧密结合(图6)。接着，把电缆测试仪作为信号源，发出脉冲电磁波，通过同轴电缆进行传输，同时接收从电缆中反射回来的脉冲信号。数据记录仪接到电缆测试仪的上部，记录、存储从同轴电缆中反射的脉冲信号，为后续分析做准备。通过TDR系统确定滑动面位置，对不同深度的滑坡体位移动态进行记录分析，定位监测对滑坡深部位移，在工程中具很好的应用前景[37-38]。

试剂：乙腈、甲醇均为色谱级（上海安谱有限公司）；磷酸、丙酮、氯仿、乙醚、异丙醇、正己烷、乙醇、四氢呋喃、磷酸钾、冰醋酸、超纯水均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）；微孔滤膜（直径13 mm，孔径0.45μm，购自上海安谱有限公司）；棉酚标准品为HPLC级（G8761 Sig ma公司），棉籽粕（粗蛋白质含量为47%，粉碎过40目筛）。

0.2 %磷酸缓冲液的配制：用5.0 mL移液管移取2.35 mL磷酸于1 000 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度。

乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液的配制：量取150 mL 0.2%磷酸缓冲液于1 000 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。

同时，快车节约时间可利用快车断面客流及越行段的节省时间得出。以远期早高峰(见表5)为例，上行方向留仙洞站—上屋北站的断面客流为5 876 人次/h，快车共运行4个站，节省4.0 min(按照快车越行1个站节约1 min的原则)，则快车在上行方向留仙洞站—上屋北站的节省时间为392 h。以此类推，其余时段及各区段节省时间计算方法同上，则早高峰、晚高峰及平峰快车节省的时间分别为3 710 h、3 358 h、19 894 h。因此，全日快车节省时间约为2.70万h。

“早不下晚不下,非赶这个时候下。老天爷,你他妈成心找人别扭啊!”杨秉奎扭动着布满胡茬的嘴,喃喃地咕哝着。天仿佛就是要跟杨秉奎找别扭似的,霎时间雷声大作,暴雨倾盆。

1.2 试验方法

对各种提取剂的提取效果、稳定性（表1）和色谱图（图2）的分析表明，具有较高提取率的提取剂为：氯仿－乙醇－异丙醇（体积比为40∶40∶20）、丙酮、氯仿－乙醇－乙醚－异丙醇（体积比为40∶40∶10∶10）、氯仿－乙醇（体积比为40∶60）溶液，其中以氯仿－乙醇－异丙醇（体积比为40∶40∶20）溶液的提取率最高，其次为丙酮；对于这4种提取剂，测定棉酚在24 h后的稳定性，发现棉酚在丙酮中稳定性最好；从色谱图来看，4种提取剂处理样品的色谱峰都不是很理想，这可能与棉籽粕中存在的大量棉酚衍生物有关，需要经过一定的前处理。相比于其他3种提取剂，丙酮处理样品的色谱峰峰形、分离度、灵敏度相对较好。综合棉酚提取率、稳定性、色谱峰等因素，本试验选择以丙酮作为棉籽粕中游离棉酚的提取剂。

称取棉籽粕样品3.0 g，置于50 mL离心管中，加 丙 酮 30 mL，40 ℃ 超 声 30 min，25 ℃3 000 r／min离心10 min，收集上清液于100 mL容量瓶中，重提3次，合并提取液，0.45μm微孔抽滤，旋转蒸发，用乙腈－0.2%磷酸溶液溶解并置于50 mL容量瓶，定容至刻度，低温避光保存，0.45μm微孔过滤，以备上机。

本试验筛选的最佳提取工艺为：53 k Hz 40℃超声提取30 min，3 000 r／min 25℃离心10 min，重复提取3次，合并上清液，抽滤，旋转蒸发掉丙酮，用乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液溶解。此工艺提取彻底，分离度高，灵敏度高，样品回收率高。

由表2可知，相比于摇床振荡和浸提的提取效果，超声提取率高；在超声提取过程中，提取效率并不随着时间的增加而增加，而是超声30 min时效果最好，但进行1次超声波处理，样品提取不够彻底，经过3次提取后，样品中的棉酚提取完全；样品的提取率随超声温度的升高先升高后降低，当温度为40℃时，提取率最高，而温度超过45℃时，提取率反而呈下降趋势；超声处理的样品3 000 r／min离心10～20 min，样品分离效果均较好，故取10 min。

棉酚标准溶液的配制：精确称取3.06 mg标准品，置于25 mL的棕色容量瓶中，用乙腈－0.2%磷酸溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为122.4 μg／mL的棉酚标准储备液，低温避光保存。

2 结果与讨论

2.1 溶剂选择

在已知棉籽粕样品提取溶液中添加不同浓度的棉酚标准品溶液，根据浓度与峰面积成正比的依据，从而确定目的峰的保留时间。样品中游离棉酚目的峰的保留时间有时会因流动相的原因而有所偏移，但目的峰与附近杂峰有良好的分离度，不会影响目的峰的确定。

本试验通过对丙酮、乙醇、甲醇、95%乙醇－水－乙醚－冰乙酸（体积比为71.5∶28.5∶20∶0.02）、异丙醇－正乙烷（体积比为60∶40）、乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液等溶剂的比较，发现棉酚在乙醇、甲醇等溶剂中不稳定，在丙酮中容易与丙酮耦合，不利于棉酚在色谱柱中的分离，且峰形不佳，而以乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液作为溶剂时，样品稳定性良好，分离效果好，峰形理想，灵敏度高（图1）。根据棉酚分子结构可知，第1、6、7位上的羟基比较活泼，容易脱去氢原子，使棉酚在溶剂中呈较强酸性，在溶剂中加入磷酸，可以抵制棉酚分离，提高其稳定性。因此，本试验选择乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液作为棉酚的溶剂。

2.2 提取剂选择

根据棉酚在各溶剂中的溶解性，比较多种提取剂（表1）的提取率和对色谱分离效果的影响。

1.2.1 样品前处理方法

图1 棉酚标准品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chr o matogr a m of standar d gossypol

表1 不同有机溶剂的棉酚提取率和稳定性比较Table 1 Co mparison of different organic solvents f or gossypol extraction rate and stability

2.3 提取工艺选择

评价提取工艺时，要求提取率高、回收率高，样品在溶剂中的稳定性好，色谱峰分离度高。因此，本试验在筛选出溶剂、提取剂的基础上，比较了不同提取工艺（表2）对棉酚分离效果的影响（图3）。

色谱柱 Agilent TC－C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈∶0.2%磷酸＝85∶15（体积比），流速1.0 mL／min，紫外检测波长235 n m，进样量20μL，柱温25℃。

图2 不同有机溶剂提取棉籽粕中棉酚的色谱图比较Fig.2 Co mparison of different organic solvents f or chro matogram of gossypol extracted fr o m cottonseed meal

表2 不同提取工艺的棉酚提取率比较Table 2 Co mparison of gossypol extraction rates in diff erent extraction processes

图3 丙酮提取棉籽粕中棉酚蒸发前、后的色谱图比较Fig.3 Co mparison of acetone evaporated bef or e and after f or chr o matogra m of gossypol extracted fr o m cottonseed meal

由图3可见，对丙酮提取的样品进行检测，发现色谱峰峰形不佳，分离度差，而样品经旋转蒸发并用乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液溶解后，色谱峰峰形良好，分离度高，杂峰干扰小。在溶解蒸发瓶上的残渣时，需加30 mL溶剂并超声溶解，多次润洗蒸发瓶以减少样品损失，确保高回收率。

1.2.2 色谱条件

以测井、岩心和三维高分辨率地震资料为基础，以高分辨率层序地层理论为指导，运用精细地层划分和对比技术，将研究区沙三中、下亚段，分别划分为6个和3个短期旋回，建立准确的层序地层格架，在此基础上明确了三角洲沉积模式。

2.4 流动相选择

随着流动相中有机溶剂比例的增加，棉酚被洗脱的速度加快，即保留时间变短，但这不利于游离棉酚与其衍生物及其他杂质的分离。为筛选出最佳的流动相并获得适合的保留时间，本试验用等度洗脱和梯度洗脱2种方式比较多种流动相组成和比例（表3）对样品中棉酚分离效果的影响（图 4、图5、图6）。

表3 不同流动相组成和比例对棉籽粕中棉酚分离效果的影响Table 3 Effects of different mobile phase co mponents and their proportion on the separation of gossypol fr o m cottonseed meal

由表3和图4、图5、图6可知，等度洗脱相比于梯度洗脱，目的峰与杂质峰分离良好，峰形理想，保留时间稳定；采用等度洗脱方式，以乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液为流动相，随乙腈比例的降低，杂质干扰减小，但峰变宽，灵敏度降低，保留时间延长。综合分析认为，乙腈与0.2%磷酸的体积比为85∶15时，所得色谱图峰形良好，分离度高，信号强，灵敏度高，保留时间（约8.30 min）适合。因此，本试验选择乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液为流动相。

一方面，酒店业行业是一种劳动密集型的服务性行业，普通员工入职都是从基层做起，所以人员录用的门槛较低，从社会招聘的从业人员的素质参差不齐，人员的录用门槛和复杂性在一定程度上决定了饭店业复杂的工作氛围，工作氛围的复杂性造成员工跳槽思想变得正常和随意化；另一方面，酒店行业大都有面临经营的季节性，淡旺季的经营差别也致命整个饭店行业的员工需求弹性较大，有一些酒店不得不根据淡旺季的员工需求量来安排员工的人数，人员的经常变动也会增加员工的不安全和不稳定感，影响到从事饭店业的人。

图4 2种流动相等度洗脱的棉酚标准品色谱图比较Fig.4 Co mparison of t wo kinds of mobile phases f or chr o matogram of gossypol standard with isocratic elution

2.5 目的峰的确定

棉酚呈弱酸性，易溶于甲醇、氯仿等有机溶剂，难溶于水。溶剂对样品的稳定性有一定影响：一些溶剂易与目标物质形成耦合，棉酚在某些溶剂中则容易出现结构变异，如棉酚在氯仿中形成醛式、乙醇酮式、羟基内醚式异构体，其比例为6∶2∶1［14］。因此，选择溶剂时，应考虑样品稳定性、分离度和安全性。

图5 不同比例乙腈－0.2%磷酸溶液为流动相等度洗脱时的棉酚（棉籽粕提取）色谱图比较Fig.5 Co mparison of different mobile phases f or chr o matogram of gossypol that was extracted fr o m cottonseed meal.The mobile phase was an isocratic solvent consisting of 0.2%phosphoric acid in acetonitrile／water.

图6 以乙腈－0.2%磷酸溶液为流动相，按表3中3种方式梯度洗脱时的棉籽粕色谱图比较Fig.6 Co mparison of three kinds of elution means（Table 3）f or chr o matogr am of gossypol that was extr acted fr o m cottonseed meal.The mobile phase was a gradient solvent consisting of 0.2%phosphoric acid in acetonitrile／water.

2.6 标准曲线绘制

精密吸取“1.1”项下的棉酚标准储备液，用乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液稀释，并配制系列浓度的棉酚标准溶液：0.122 4、0.244 8、0.489 6、0.979 2、1.958 4、3.916 8、7.833 6、9.792 0、19.584 0、39.168 0、78.336 0μg／mL，在最佳色谱条件下进行检测，对峰面积y与浓度x进行线性回归，得回归曲线（图7），其回归方程为y＝189 347x＋24 969，r＝0.999 99，在线性范围为0.1224～78.336μg／mL，浓度与峰面积呈良好线性关系；以3倍的信噪比，得其最低定量限为0.52 mg／kg。栾姝等［11］在测定棉籽仁中棉酚的含量中，建立的标准曲线在浓度范围为1.9～34.9μg／mL，r＝0.999 7；唐辉等［15］在食用棉籽蛋白中总棉酚与游离棉酚含量测定的研究中，建立的标准曲线在线性范围为2.0～8.0μg／mL，r＝0.999 4；吴伟伟等［10］在测定棉籽饼粕饲料中游离棉酚的研究中，建立的标准曲线在线性范围为 0.8～54.0 μg／mL，最 低 检 出 浓 度 为0.94 mg／kg，与上述研究相比，本标准曲线的定量范围广、定量限低、准确度和灵敏度高。

图7 游离棉酚的标准曲线Fig.7 The standar d curve of free gossypol

2.7 方法精密度测定

精密吸取“1.1”项下的棉酚标准储备液，配制成1.2、4.7、14.6μg／mL 3个不同浓度的棉酚标准溶液，1 d内测定5次，间隔3 h，并连续测定5 d，计算其日内和日间峰面积平均值及其相对标准偏差（表4）。可知，1.2、4.7、14.6μg／mL 3个不同浓度的标准溶液日内精密度的相对标准偏差分别为2.21%、0.25%、0.43%；日间精密度的相对标准偏差分别为2.84%、0.85%、1.05%，说明棉酚标准溶液在乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液中的稳定性好，仪器精密度及其稳定性良好。

表4 棉酚标准品的日内及日间精密度的测定Table 4 Deter mination of within－day and inter－day precision of gossypol standard

2.8 回收率测定

精确称取9份已知棉酚含量的棉籽粕样品3 g，分成3组，每组3个平行，每组分别加入棉酚标准品0.93、1.83、3.84 mg，测定其含量，计算平均回收率及其相对标准偏差（表5）。可知，棉籽粕样品中棉酚标准品的回收率为94.72%～99.49%，相对标准偏差为1.72%～3.13%，表明样品的处理方法适合，回收率高，准确性好。

表5 棉酚回收率的测定Table 5 Deter mination of gossypol recovery rates

2.9 稳定性测定

精密称取棉籽粕样品3份，按照建立的处理方法进行处理，并保存于4℃的冰箱中，在最佳色谱条件下，在配制后的0、3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 h测定其稳定性，记录其峰面积并计算其相对标准偏差。可知，3个样品在60 h内的峰面积的相对标准偏差分别为9.21%、8.99%、8.40%（表格略），而在36 h内其峰面积相对标准偏差分别为1.51%、3.42%、3.43%（表6），说明棉籽粕样品中游离棉酚溶解于乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液中在4℃条件下36 h内的稳定性良好，36 h后不稳定，处理的棉籽粕样品需要在36 h内完成测定，与文献［16］报道一致。

针对数字化发展的趋势，德国木工机械制造商协会总经理Bernhard Dirr博士表示，德国机械设备制造业联合会和欧洲木材加工机械制造商联合会目前正基于OPC UA（开放式平台通信统一架构），制定相关标准。这将为现代木材加工注入新动力，现在，该领域诸多细分市场已大范围实现技术成熟。即使是规模较小的工厂，也能全面掌控智能化发展趋势，轻松接入国际网络，化身具备高度灵活性的小型工厂。

表6 棉籽粕中棉酚稳定性的测定Table 6 Deter mination of the stability of gossypol extracted fro m cottonseed meal

2.10 棉籽粕中游离棉酚检测

称取3 g棉籽粕样品5份，根据前面建立的HPLC法，测定棉籽粕样品中的游离棉酚含量，计算其平均值及其相对标准偏差（表7）。可知，同一棉籽粕5次测定的平均值为60.05 mg／kg，相对标准偏差为0.642%，表明该方法测定准确，重复性好。

在制定还管理制度以后，为了避免员工执行的问题，使经济管理达成应有的效果，企业还要加强内部监督，建立完善科学的监督机制。这种监督机制不要求一成不变，而要求根据经济管理模式的情况来进行完善与调节。另外，企业还要根据市场营销的模式发展情况，采取适当的企业的经济管理监督措施，发挥监督机制的经济管理职能。

表7 棉籽粕中游离棉酚含量的测定Table 7 Deter mination of free gossypol content in cottonseed meal

3 结 论

本试验优化了检测棉籽粕中游离棉酚含量的HPLC法：以丙酮为提取剂，经超声、离心、抽滤、旋转蒸发处理，用乙腈－0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液溶解并以其为流动相，此方法稳定性好，精密度、准确度、灵敏度和回收率高。

致谢：感谢上海第二军医大学药学院董晰教授和日本岛津公司分析与检测中心的周璐颖工程师对本文所提出的宝贵意见。

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