NDRG1与Hpa在肝癌中的表达及与肝癌浸润转移的关系

高峰 杨季红 刘渤 刘玉英 马芳

肝癌是世界范围内高发肿瘤，因其侵袭转移性强而成为临床治疗的难点，因此寻找肝癌治疗中的靶分子指标显得尤为重要。近年NDRG1基因表达与肿瘤生物学特性的关系备受关注，有研究发现NDRG1在肝细胞癌、结肠癌［1，2］等多种人类肿瘤中高表达，据此认为NDRG1作为癌基因参与并促进了肿瘤发生发展过程。但也有相反观点认为NDRG1是一种与细胞分化程度呈正相关的抑癌基因［3］。乙酰肝素酶(Hpa)是一种在多种恶性肿瘤中高表达且与肿瘤侵袭转移有极高相关性的葡萄糖醛酸内切酶［4］。关于NDRG1和Hpa异常表达与肝癌侵袭转移关系的研究文献未见报道，本研究应用免疫组织化学方法联合检测NDRG1和Hpa在肝癌中的表达，探讨二者在肝癌侵袭、转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究中46例经病理证实的肝癌组织和12例肝血管瘤等正常肝组织取自本院2007年7月至2011年6月手术切除标本，所有患者术前均未经过放、化疗及免疫治疗。46例肝癌患者中，男30例，女16例;年龄28～69岁，平均年龄46岁;按照Edmonson病理学分级，Ⅰ、Ⅱ级26例，Ⅲ、Ⅳ级20例。癌旁组织均取自距肿瘤边缘1～2 cm的非肝癌组织。正常肝组织为同期手术治疗的肝脏良性疾病，其中肝血管瘤4例，肝囊肿3例，肝外伤5例。标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋保存。

1.2 主要试剂 羊抗人NDRG1(N-19)多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，兔抗人Hpa多克隆抗体为美国LAB VISION公司产品，PV-9003、PV-9001超敏即用型二步法(非生物素)检测试剂盒为美国GBI公司产品，浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色 将石蜡组织块以4 μm厚度连续切片，分别做HE和免疫组织化学染色，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化;3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶15 min。NDRG1抗原修复采用柠檬酸抗原修复液(0.01 mol/L，pH=6.0)、高压热修复。Hpa行磷酸盐缓冲液(PBS)微波修复抗原。分别滴加羊抗人NDRG1(N-19)多克隆抗体(1∶100)，兔抗人Hpa多克隆抗体(1∶50)，4℃过夜。滴加二步法检测试剂(按照说明书操作)，DAB显色。PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性组织作为阳性对照。

1.4 免疫组织化学结果判断 NDRG1阳性染色位于细胞质和(或)细胞膜，Hpa阳性染色主要分布于细胞质。二者阳性信号均为黄-棕黄色颗粒，小片状或弥漫性分布。高倍镜下随机观察10个视野，每个视野计数100个细胞，按照阳性细胞所占百分比与着色强度采用双评分半定量法进行评分。(1)阳性细胞所占百分比评分标准:阳性细胞＜25%为0分，25% ～50%为1分，51% ～75%为2分，＞75%为3分。(2)着色强度评分标准:不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。取(1)(2)项评分相加，0～1分为阴性(－)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.5 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，应用Wilcoxon秩和检验对NDRG1，Hpa在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中的表达结果进行分析，应用Spearman等级相关检验对NDRG1，Hpa表达之间及与临床病理指标的相关性进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NDRG1与Hpa在肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达

NDRG1与Hpa蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于其对应的癌旁组织及正常肝组织(P＜0.01);NDRG1与Hpa蛋白在癌旁组织和正常肝组织中的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1，图 1、2。

图1 肝癌组织中NDRG1蛋白的表达(SP×400)

图2 肝癌组织中Hpa蛋白的表达(SP×400)

表1 NDRG1和Hpa在肝癌、癌旁、正常肝组织中的表达例

2.2 NDRG1与Hpa的表达与肝癌临床病理特征的关系

NDRG1蛋白表达水平与门静脉有无癌栓，肝内或淋巴结转移间差异有统计学意义(P＜0.05)。HPA蛋白表达水平与肿瘤大小、有无肝内或淋巴转移以及肝癌组织分化程度间差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 NDRG1与HPA在肝癌组织中的表达与肝癌临床病理因素的关系 例

2.3 NDRG1与Hpa在肝癌组织中表达的相关性 在HCC组织中NDRG1与Hpa的表达呈正相关(r=0.617，P＜0.01)。见表3。

表3 HCC组织中NDRG1和HPA的关系 例

3 讨论

NDRG家族是近年才被逐渐发现的一族与细胞分化相关的新基因［5］。NDRG1最初是在小鼠胚胎组织中发现的，因受N-myc的抑制而得名，该基因与肿瘤发生发展的关系密切，但其对肿瘤是否具有抑制或促进作用仍存在争论［2，6，7］。以往关于NDRG1在肿瘤组织中表达情况的研究主要集中在前列腺癌、结直肠癌及脑胶质瘤等，且研究结果有较大差异［3］。最初研究发现，NDRG1在前列腺癌、结肠癌中低表达，而在体外诱导分化的结肠癌细胞中高表达，因而推断其可能是一种与细胞分化程度呈正相关的抑癌基因［3］。但 Koshiji等［2］研究显示NDRG1在结直肠癌中表达明显增加，视不同种族结直肠癌患者，NDRG1蛋白表达和组织病理类型、Duke’s分级、淋巴管或静脉浸润等临床病理特征明显相关。另有报道，NDRG1蛋白在恶性黑色素瘤、脑瘤、肾癌、肺癌等多种恶性肿瘤组织中高表达，而在正常组织中低表达，认为可以把NDRG1蛋白作为一种新的检测恶性肿瘤的标志物［8］。检索文献，关于NDRG1基因与肝细胞癌的关系的研究报道较少。何静等［9］检测了NDRG1在肝癌和配对的癌旁组织、正常肝组织、人胎肝组织及胚胎各组织、发育不同时期小鼠肝和以及多种细胞系中的表达谱，结果表明NDRG1在正常肝组织和癌旁组织中表达量显著低于肝癌组织中的表达量，而正常肝组织和癌旁组织表达量差异不明显，NDRG1的表达量随人胎肝和婴鼠肝的逐渐发育而增高，至已达分化的成年肝又转而降低，提示NDRG1可能是一种在细胞分化的一定阶段呈高表达的与细胞分化相关的基因。本研究结果表明，NDRG1蛋白在肝癌组织中的表达显著高于其癌旁组织及正常肝组织(P＜0.01)，这与何静等［9］的研究结果相一致，另外还发现，NDRG1蛋白表达水平与门静脉有无癌栓，肝内或淋巴结转移差异有统计学意义(P＜0.05)。这些结果提示NDRG1可能作为潜在的癌基因在肝细胞癌的发生及其演进中起一定作用。有研究发现缺氧条件可诱导NDRG1基因在肿瘤组织中的高表达［10］，故而认为NDRG1在肿瘤组织中高表达可能与实体肿瘤组织缺氧有关，但确切机制尚待继续研究。

乙酰肝素酶(Hpa)是近年较受关注的具有促肿瘤作用的内源性糖苷酶，通过对细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链的切割作用，促进肿瘤细胞的浸润和转移，还可以促进肿瘤细胞分裂、趋化、微血管形成。人类结肠癌的早期可以检测到Hpa mRNA和蛋白聚集，而随着病变进展(重度不典型增生-高分化腺癌-低分化腺癌)Hpa水平逐渐增高，而在邻近正常组织无表达［11］。研究发现，HPA在肝细胞癌中高表达，并与肿瘤的侵袭和转移密切相关［12］。Chen等［13］对120例原发性肝癌的研究发现，Hpa在肿瘤组织中显著高表达，且与TNM分期、肿瘤大小、门静脉癌栓或肿瘤发生转移相关。本研究中，Hpa蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于其对应的癌旁组织及正常肝组织，在癌旁组织和正常肝组织中的表达差异无显著性。肝内和淋巴结转移均是反映肿瘤侵袭性的指标，本研究还发现HPA的表达与肿瘤的大小和肝内或淋巴结转移存在相关，提示HPA对肝癌的浸润转移有重要的促进作用。本研究还发现HPA与肝癌组织的分化程度相关，低分化的肝癌组织存在更高的HPA表达强度，说明HPA在肝癌的病程演进中起着一定作用。门静脉癌栓亦能反映肿瘤的外侵能力，但在本研究中未发现HPA的表达与门静脉癌栓相关，这与Chen等［13］的报道存在差异，可能与样本例数偏少有关，尚有待于增加样本量进一步研究。

综上所述，NDRG1、HPA在肝细胞癌组织中高表达，提示二者可能共同参与肝细胞癌的侵袭和转移，联合检测NDRG1、HPA有助于判断肝细胞癌的转移潜能和患者的预后，并可能为肝细胞癌的治疗提供新的分子靶点和策略。

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