细胞色素C对庆大霉素致大鼠肾小管上皮细胞毒性的影响研究

李六水，高燕，李忠东#（1.安徽医科大学药学院，合肥3003；.空军总医院药学部，北京10014）

庆大霉素是临床上常用的氨基糖苷类抗生素（AGs）之一，广泛用于革兰阴性杆菌感染的治疗，其主要作用特点是随剂量的增加，其抗菌效果增强。目前，由于临床上耐药菌多见，庆大霉素等抗菌药物的使用剂量越来越大，这无疑又加重了其不良反应的发生，如庆大霉素的肾毒性等。如何预防庆大霉素随剂量增加所致的毒性增强，是药物靶器官毒性防治领域的重要内容之一。细胞色素C（Cytochrome C）是从猪心中提取的含铁卟啉的细胞呼吸激动药，临床上广泛用于各种组织缺氧的急救或辅助治疗，如一氧化碳中毒、安眠药中毒、严重休克期缺氧以及肺部疾病引起的呼吸困难和心肌缺氧的治疗等[1]。Watanabe A等[2]以同位素示踪的方法发现，细胞色素C 0.8、8、80 mg·kg－1与低剂量庆大霉素0.1 mg·kg－1单次联合给药后2 h，大鼠肾脏中庆大霉素蓄积的量比对照组分别减少了约3.5%、35.7%、67.9%；细胞色素C 100 mg·kg－1可显著降低庆大霉素30 mg·kg－1所致大鼠尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的量。由于目前庆大霉素的临床用量越来越大，因此本研究在Watanabe A等研究基础上，利用AxSYM全自动免疫分析仪，根据荧光偏振免疫发光技术（FPIA）原理测定了庆大霉素的含量，观察细胞色素C 100 mg·kg－1对高剂量庆大霉素100 mg·kg－1单次给药后在大鼠肾脏中蓄积量的影响，并观察细胞色素C对庆大霉素致大鼠肾小管上皮细胞毒性的影响，为临床应用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

MIAS医学图像分析系统（北京航空航天大学研究开发，由空军总医院孟如松教授提供，已获北京市医疗器械准产许可证，注册号:京药管械（准）字2001第2210233号；已被广泛用于图像分析[3]）；AxSYM全自动免疫分析仪（美国Abbott公司）；DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

细胞色素C注射液（安徽宏业药业有限公司，批号:100944，规格:15 mg∶2 mL）；硫酸庆大霉素注射液（广州白云山天心制药股份有限公司，批号:101136，规格:8万u∶2 mL）；AxSYM庆大霉素检测试剂盒、AxSYM庆大霉素定标液、Ax-SYM庆大霉素质控液（美国Abbott公司，批号:93021、92476、90247）；脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端原位标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（瑞士罗氏公司，批号:12176400）。

1.3 动物

SPF级健康Wistar大鼠30只，♂，体重180～200 g，购于军事医学科学院实验动物中心，动物许可证号:SCXK（军）2007-004。

2 方法

2.1 分组与给药

将所有大鼠分笼饲养，自由摄食与饮水，室温25℃左右，相对湿度55%左右。经适应性饲养2 d后随机分为溶媒对照组、庆大霉素组、庆大霉素+细胞色素C组，每组10只。溶媒对照组腹腔注射生理盐水，庆大霉素组腹腔注射庆大霉素100 mg·kg－1·d－1，庆大霉素+细胞色素C组先尾静脉注射细胞色素C 100 mg·kg－1·d－1，约30 min后腹腔注射庆大霉素100 mg·kg－1·d－1。

2.2 肾脏标本采集与处理

单剂量给药后24 h处死大鼠，迅速剖腹摘取双侧肾脏，用生理盐水洗净表面残血，并用滤纸吸干表面水分。每只大鼠的左肾称重后加入生理盐水，用组织匀浆机制备成6 mL的肾组织匀浆，用于测定肾脏中药物浓度。每只大鼠右肾经纵切大致均分为2个部分，1/2用生理盐水湿润的纱布包裹后置于－20℃中储存，用于细胞凋亡检测；另1/2置于4%中性甲醛溶液中固定，用于组织病理学观察。

2.3 肾组织中庆大霉素的含量测定

将制备好的肾组织匀浆置于振荡器上涡旋混匀，取40 μL匀浆，加生理盐水稀释10倍，10 000 r·min－1离心10 min，取上清液置于AxSYM样品杯中，以AxSYM全自动免疫分析仪测定肾组织中庆大霉素的含量，重复3次，并同时测定AxSYM庆大霉素高、中、低3个质控液浓度。如果3个质控液浓度均在允许范围内，则样品测定结果符合要求，然后将每组大鼠的检测结果折算成每克肾组织含庆大霉素的质量（μg·g－1）。

2.4 肾小管上皮细胞凋亡情况

采用TUNEL法检测各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡，在400倍荧光显微镜（激发光波长450～500 nm）下观察凋亡阳性细胞，呈现绿色颗粒状细胞判定为凋亡阳性细胞。具体操作方法严格按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。

2.5 肾小管上皮细胞凋亡图像分析

在每张大鼠肾组织切片组织区域划定一个大小几乎相等的长方形亚区域，在4个角和中心区5个视野采集图像，用MIAS医学图像分析系统计算阳性细胞数密度（单位统计场面积内凋亡阳性细胞数，阳性细胞数密度＝凋亡阳性细胞总个数/统计场总面积）。

2.6 肾组织病理学变化

将中性甲醛溶液固定的大鼠肾组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，行常规苏木精-伊红（HE）染色，在400倍光镜下观察各组大鼠肾组织病理学变化，每张切片选取5个不重叠视野，采集图片观察。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 庆大霉素的含量变化

结果表明，庆大霉素组大鼠肾组织中庆大霉素含量为（335.16±99.18）μg·g－1；庆大霉素+细胞色素C组大鼠肾组织中庆大霉素含量为（221.67±71.12）μg·g－1。与庆大霉素组比较，庆大霉素+细胞色素C组大鼠肾组织中庆大霉素蓄积量降低了33.86%（P＝0.043＜0.05）。

3.2 肾小管上皮细胞凋亡变化

结果表明，溶媒对照组TUNEL染色阳性细胞数较少，庆大霉素组TUNEL染色阳性细胞数明显增多，庆大霉素+细胞色素C组较庆大霉素组TUNEL染色阳性细胞数有所减少。3组凋亡阳性细胞数密度分别为（111.26±95.35）、（637.78±169.64）、（404.75±135.57）n·mm－2。与溶媒对照组比较，庆大霉素组肾小管上皮细胞凋亡的阳性细胞数密度明显增加（P＜0.01）；与庆大霉素组比较，庆大霉素+细胞色素C组肾小管上皮细胞凋亡的阳性细胞数密度减少了36.53%（P＜0.05）。各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡的阳性细胞数密度比较见图1。

图1 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡的切片图（×400）Fig 1 Slices chart of rat renal tubular epithelial cells apoptosis（×400）

3.3 肾组织病理学变化

结果表明，溶媒对照组大鼠肾组织结构清楚，肾小球无明显充血或肿胀；庆大霉素组大鼠肾小管上皮细胞水肿、空泡变性，细胞刷状缘脱落，肾间质内可见炎细胞浸润，偶见肾小球充血肿胀；庆大霉素+细胞色素C组大鼠肾组织病变程度较庆大霉素组明显减轻。各组大鼠肾脏组织病理学切片见图2。

图2 各组大鼠肾脏组织病理学切片（×400）Fig 2 Pathological slices of rat kidneys（×400）

4 讨论

肾小管上皮细胞是庆大霉素毒性靶细胞[4]。Mouedden ME等[5]用TUNEL染色法和甲基绿-派洛宁染色法证实，庆大霉素10 mg·kg－1·d－1连续腹腔注射给药4 d后，可以导致大鼠肾小管上皮细胞凋亡；刘冬娟等[6]通过给大鼠腹腔注射庆大霉素100 mg·kg－1·d－1，分别连续给药5、8、10 d后，在透射电镜下均观察到肾小管上皮细胞凋亡。本研究以高剂量庆大霉素100 mg·kg－1·d－1单次腹腔注射给药后，采用TUNEL法也明显观察到大鼠肾小管上皮细胞出现凋亡，提示肾小管上皮细胞凋亡可能是庆大霉素肾毒性的主要机制。

目前已证实，庆大霉素主要与肾小管上皮细胞膜表面的Megalin受体结合，然后通过胞饮方式进入并蓄积于肾小管上皮细胞内[7]。Megalin受体是一种低密度脂蛋白受体[2]，在肾小管上皮细胞表面大量表达[8]，其有多种配体，如多粘菌素B、胰岛素、血红蛋白、Ca2+、细胞色素C等[9]。Schmitz C等[10]发现，Megalin受体缺失型小鼠肾皮质中蓄积的庆大霉素的量仅为给药剂量的0.6%，且胃腺癌细胞（AGs）与Megalin受体的亲和力越大，则发生肾毒性的可能性越大，提示阻断庆大霉素与该受体的结合即可抑制庆大霉素的肾毒性。

本研究通过测定大鼠肾脏中庆大霉素的药物浓度，发现细胞色素C 100 mg·kg－1·d－1与高剂量庆大霉素100 mg·kg－1·d－1联用后，肾组织中庆大霉素的蓄积量比单用庆大霉素减少了33.86%。此外，本研究还表明，细胞色素C与庆大霉素联用后，肾小管上皮细胞凋亡的阳性细胞数减少了36.53%（P＜0.05），而且肾组织病理学变化有所好转，表明其原因可能为外源性给予的细胞色素C抑制肾小管上皮细胞凋亡的程度与其阻断肾组织中庆大霉素蓄积的程度相匹配；同时说明外源性给予的细胞色素C不能透过正常细胞的细胞膜[11]，不能进入细胞质诱导细胞凋亡，但结合并占据细胞膜表面的Megalin受体，从而竞争性地阻断庆大霉素与Megalin受体的结合，使肾小管上皮细胞内庆大霉素的蓄积量减少。

总之，本研究从3个角度即肾组织药物浓度测定、肾小管上皮细胞凋亡检测和组织病理学观察证明，细胞色素C可能通过抑制庆大霉素在大鼠肾脏中的蓄积来减轻其肾毒性。

[1]陈新谦，金有豫，汤 光.新编药物学[M].第17版.北京:人民卫生出版社，2011:162.

[2]Watanabe A，Nagai J，Adachi Y，et al.Targeted prevention of renal accumulation and toxicity of gentamicin by aminoglycoside binding receptor antagonists[J].J Control Release，2004，95（3）:423.

[3]陈艳艳.甘草黄酮对大强度耐力运动大鼠肾脏组织细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响[J].北京体育大学学报，2011，34（2）:61.

[4]Karasawa T，Wang Q，David LL，et al.CLIMP-63 is a gentamicin-binding protein that is involved in drug-induced cytotoxicity[J].Cell Death Dis，2010，1（11）:e102.

[5]Mouedden ME，Laurent G，Mingeot-Leclercq MP，et al.Apoptosis in renal proximal tubules of rats treated with low doses of aminoglycosides[J].Antimicrob Agents Chemother，2000，44（3）:665.

[6]刘冬娟，赖亚新，徐彦平，等.庆大霉素致大鼠肾近端小管上皮细胞凋亡的超微结构研究[J].中国药物警戒，2009，6（12）:709.

[7]Nagai J，Tanaka H，Nakanishi N，et al.Role of megalin in renal handling of aminoglycosides[J].Am J Physiol Renal Physiol，2001，281（2）:337.

[8]Nagai J.Molecular mechanisms underlying renal accumulation of aminoglycoside antibiotics and mechanism-based approach for developing nonnephrotoxic aminoglycoside therapy[J].Yakugaku Zasshi，2006，126（5）:327.

[9]Nagai J，Takano M.Molecular aspects of renal handling of aminoglycosides and strategies for preventing the nephrotoxicity[J].Drug MeTab Pharmacokinet，2004，19（3）:159.

[10]Schmitz C，Hilpert J，Jacobsen C，et al.Megalin deficiency offers protection from renal aminoglycoside accumulation[J].J Biol Chem，2002，277（1）:618.

[11]蔡华伟，万 琳，杨 浩，等.人源细胞色素C在大肠杆菌中的重组表达和分离纯化[J].生物医学工程学杂志，2007，24（3）:620.