医疗器械遗传毒性评价方法的应用现状及研究进展

曾冬明，侯丽，施燕平

1 国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心，济南，250101 2 山东省医疗器械生物学评价重点实验室，济南，250101

【作 者】田少雷国家食品药品监督管理局药品认证管理中心，北京市，100061

医疗器械遗传毒性评价方法的应用现状及研究进展

【作者】曾冬明1，2，侯丽1，2，施燕平1，2

1 国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心，济南，250101 2 山东省医疗器械生物学评价重点实验室，济南，250101

简要地介绍了国内外医疗器械遗传毒性评价方法的应用现状及研究进展，并分析了未来的发展趋势。

医疗器械；遗传毒性；应用现状；研究进展

【 Abstract 】The overseas and domestic application status and research progress of genotoxicity evaluation of medical devices is

briefly introudeced. The trend of future development is analyzed.

随着现代科技的发展，用于医疗器械产品的新技术、新材料日益丰富与多样。大量新型医疗器械产品的涌现，要求毒理检测部门对其毒性作出及时准确的检测与判断，其中遗传毒性检测是其重要的内容之一。遗传毒性试验作为医疗器械安全性评价的一个内容始于八十年代后期。ISO/TCl94医疗器械生物学评价技术委员会的成立和相关标准的制定[1]，对于促进医疗器械行业、保障人类健康的发展发挥了重要作用。由于没有单独一个遗传毒性试验方法可检测所有的遗传毒性终点，故遗传毒性的评价大多采用组合试验的方法。各国制定的遗传毒性试验项目在方法学分类上较为接近，但具体的方法组合不尽相同，甚至同一国家中不同实验室之间也有差异。近年来，随着毒理学相关领域特别是分子生物学的发展，遗传毒性测试评价方法也在不断改进与完善。本文概述了目前遗传毒性试验诸多评价方法的应用情况及该领域的研究进展，并浅析今后的发展趋势。

1 医疗器械遗传毒性试验方法的应用现状

1.1 国外遗传毒性试验组合

经过多年的发展，遗传毒性试验已经了包括原核生物、真核生物、体内和体外试验等多种体系，所涉及的方法已经超过200种[2]。这些方法各有优劣，尚未发现一种单一的试验方法在检测终点的覆盖范围、DNA损伤等多种遗传特异性等检测方面均达到令人满意的程度。因此，国内外同行都一致认为，只有使用一组试验方法，才能对化学物的遗传毒性作出较可靠的评价。各国采用的遗传毒性评价方法较为相似，但具体的实施方案有所不同[2-3]。

表1 一些国家医疗器械遗传毒性试验组合Tab.1 Medical advices in some coutries

1.2 国内现行标准与采用的试验组合方法

目前，国内医疗器械遗传毒性评价方法主要依据GB/T 16886.3-2008（等同转化ISO 10993-3:2003）标准。该标准明确提出，当应对医疗器械的遗传毒性进行试验评价时，应采用体外系列试验。在进行试验时，应至少在两项试验中使用哺乳动物细胞进行不同试验终点的研究[4]。该系列试验包括以下两种方案的试验。

1.2.1 方案一

(1) 细菌基因突变试验（OECD471）；

(2) 哺乳动物细胞基因突变试验（OECD476）；

(3) 哺乳动物细胞诱裂性试验（OECD473）。

1.2.2 方案二

(1) 细菌基因突变试验（OECD471）；

(2) 哺乳动物细胞基因突变试验（OECD476），特别是小鼠淋巴瘤试验包含集落数和尺寸测定，可覆盖两个终点（诱裂性和基因突变）。

国内医疗器械遗传毒性评价试验室一般的试验组合为Ames试验，体外染色体畸变试验（CA）和小鼠淋巴瘤细胞突变试验（MLA），其中MLA试验多采用96微孔板法。由于MLA试验在国内推广的时间不长，试验本身操作需专门的知识和经验，故不少实验室采用V79细胞HGPRT基因位点突变试验或体内试验代替。

1.3 现有评价体系的缺陷

在目前的医疗器械遗传毒性评价方法中，不管是ISO、OECD还是GB，关于遗传毒性评价方法都只是方法性的概述，各试验方法并没有建立行标，实验室之间方法虽然大抵相似，但具体操作甚至某些试验参数仍存在差异，不利实验室之间结果的比对。Ames试验作为遗传毒性试验的奠基石，其方法从建立至今，已历经多次修改，积累了大量的试验数据，但因其菌株突变的高度特异性，有些突变诱导物难以检出，且对于一些有毒物质或非澄清状态的样品浸提液，会产生小菌落的本底，容易误判为阳性结果。体外染色体畸变试验和小鼠淋巴瘤细胞突变试验，对试验人员的操作技能及结果判读有较高的要求（需较多的经验）。在预测受试物的致癌性方面，两个试验虽然具有很高的敏感性，但特异性却很低[5-7]。这种高频率的假阳性事件一方面降低了检测效率，一方面可能会造成一些无辜样品的误判。此外，小鼠淋巴瘤细胞突变试验只能间接评价染色体畸变，对于一些粘度较高的样品，无法有效分离细胞而导致试验失败。对于体外试验，S9的使用容易导致一些未知结果的产生，如有些含银产品的Ames试验检测，与不加S9的组别相比较，有明显差异。对于体内试验，现有的方法很难确定样品浸提液的有效成分是否到达目标靶点，敏感性较体外方法差。

2 医疗器械遗传毒性评价方法的研究进展

医疗器械遗传毒性评价方法与药物和其他化合物遗传毒性评价方法大同小异，前者来自于后者。因此，目前见报导的的新方法很少或几乎没有以医疗器械作为对象的，但这并不影响方法之间的借鉴与共用，因为毒性评价的本质对象都是化合物。以下介绍几种较有应用前景的方法：

2.1 Ames(II)[8]

1994年Ames建立了一套6个鼠伤寒沙门氏菌株(TA7001－TA7006)，可鉴定6种碱基对置换突变，每一菌株携带一专一的组氨酸生物合成操纵子的错义突变。除组氨酸突变外，这些菌株还携带了不同的可增强靶组氨酸突变的附加特性，包括具有SOS可诱导的mucAB系统的R因子pKM101、uvrB切除修复组分的缺失和rfa突变。这些菌株的自发回变率相当低(约＜10个回复突变数/皿)，检测各种致突变物的敏感性相当于TA100、TA102和TA104菌株。试验可在24或96微孔板上进行，在培养基中加入pH指示剂。当回复突变的菌株生长时，培养基pH改变，pH指示剂由红变黄，通过分光光度计测定，全过程自动加样、自动读数，只需很少量的受试物就可以在短时间内筛选大量样品，整个测试过程可在90 min内完成[9]。该试验在不需序列分析情况下即可鉴定突变谱。近来有人将TA1535、TA1537菌株及大肠杆菌（wp2 uvrA和wp2[pKM101]）纳入了Ames II试验[10]，在试验菌株组合方面有了较大的选择性。

2.2 荧光原位杂交(FISH)技术

荧光原位杂交最早由Bauman(1980)建立，1989年由Lucas首先用于染色体畸变分析。其原理是按检测目标准备合适的DNA序列作为探针，并用生物素标记，对载玻片上待测标本中的DNA杂交，最后通过杂交位点的荧光观察染色体结构或数目的改变。应用特殊染色体和染色体某区域的荧光探针，可在体内检测4种类型的细胞遗传学终点[11]：1)检测中期细胞染色体畸变；2)应用亚染色体区域的探针检测间期染色体断裂和非整倍体；3)应用中心粒探针和/或抗着丝点抗体检测微核的形成；4)哺乳动物精子非整倍体检测。

2.3 单细胞凝胶电泳技术（彗星试验）

单细胞凝胶电泳分析(SCGE)是Ostling等(1984)首创的，1988年经Singh等进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法，因其细胞电泳形状颇似慧星，又称慧星试验(cometassay)。该试验可检测不同细胞 (如皮肤角质细胞、鼻呼吸和嗅觉细胞、精母细胞和卵母细胞等)少量的DNA链断裂，方法快速简便。与经典的染色体畸变、微核等试验相比，SCGE可用于活细胞DNA的检测，也能用于死亡细胞DNA的分析，不仅可以研究低剂量下的生物效应，也可用于研究高剂量下的生物效应，而且SCGE还可提供DNA修复能力的信息，这使得SCGE非常适用于评价受试物的遗传毒性[12]。最近，Stang 等[13]利用一种特制的96孔板，改进了传统的彗星试验方法，使高通量的检测成为可能。

2.4 转基因试验系统[14-18]

2.4.1 转基因动物突变检测系统

自1989 年Gossen 等建立第一个转基因小鼠致突变检测模型以来, 转基因动物已成为检测哺乳动物体内自发突变和诱发突变的一种新的研究方法。转基因动物模型可在同一个动物体可在整体状态下检测基因突变，比较不同组织(包括生殖腺)的突变率，确定靶器官，对诱发的遗传改变作精确的分析。这些方法的一个重要优点是灵敏度高，可观察低剂量下的遗传毒性，因而更符合人体的实际情况。目前已建立了10多种转基因突变检测模型。

2.4.2 转基因细胞试验系统

该方法是将代谢酶基因转入哺乳动物细胞，如MCL细胞系表达5种主要类型的cyp450酶，可用于测试基因突变、微核等遗传毒性终点；GPTAS52哺乳动物致突变系统，包括了细菌的GPT基因，可用于测试基因突变。

2.4.3 转基因细菌

将N－乙酰转移酶、硝基还原酶和细胞色素p450等参与致突变物活化的基因导入细菌或酵母致突变实验菌株，构成细菌或酵母突变测试系统。特别是导入人体的代谢酶基因，可模拟人体的代谢情况。

3 结束语

从本实验室多年来检测的样品来看，医疗器械产品无论是数量还是品种正呈现逐年增多的趋势，目前的遗传毒性评价体系显然不能满足需求。因此，医疗器械遗传毒性评价今后的主要发展趋势之一是高通量筛检方法。目前高通量筛检方法的建立虽已有较成熟的技术支撑，比如基因芯片技术，Ames（II）试验及高通量彗星试验等，但如何选取试验组合及试验剂量等仍需进一步摸索。此外，因医疗器械产品检测不同于药品和其他化合物，一般采用模拟临床的浸提法制备试验液，各种新工艺的更新升级必然导致试验液制备方法的相应改变。如何针对不同材质不同工艺的医疗器械产品寻找出最佳的浸提方法，也是关系到整个评价试验是否成功且有意义的关键所在。

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The Application Status and Research Progress of the Genotoxicity Evaluation of Medical Devices

【Writers 】Zeng Dongming1,2, Hou Li1,2, Shi Yanping1,2
1 SFDA-Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices, Jinan 250101 2 Key Laboratory of biological evaluation of medical advices of Shandong Province,Jinan 250101

medical devices, genotoxicity, application status, research progress

【作者】田少雷国家食品药品监督管理局药品认证管理中心，北京市，100061

R318

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2012.05.014

1671-7104(2012)05-0362-03

2012-07-10

曾冬明，E-mail: dmzeng@163.com