交联剂对复合生物海绵性能的影响

李东红，李鹏熙，罗菊秀，黄露

创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室，重庆，400042

第三军医大学野战外科研究所二室，重庆，400042

交联剂对复合生物海绵性能的影响

【作者】李东红，李鹏熙，罗菊秀，黄露

创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室，重庆，400042

第三军医大学野战外科研究所二室，重庆，400042

目的 考察交联剂京尼平和戊二醛对复合生物海绵性能的影响。方法采用冷冻干燥法制得复合生物海绵，采用三硝基苯磺酸吸光光度法测交联度；采用MTT法测细胞毒性；采用溶菌酶降解法测体外降解率。结果①复合生物海绵的交联度均随交联时间的延长而增加，用京尼平和戊二醛交联三天后，复合生物海绵的交联度分别为26.43%和54.63%。②京尼平交联的复合生物海绵吸水性优于戊二醛交联的复合生物海绵。⑧用两种交联剂制得的复合生物海绵的浸提液在细胞培养初期均表现出对细胞增殖的抑制作用，这种抑制作用随培育时间的延长而降低，但戊二醛交联的复合生物海绵其细胞毒性明显高于京尼平。④京尼平或戊二醛交联的复合生物海绵在生理盐水中浸泡4周后，降解率分别为32.1% 和28.4%；而在含溶菌酶的生理盐水中浸泡40 h后，降解率分别为36.7% 和31.2%。结论与用戊二醛交联的复合生物海绵相比，京尼平交联的复合生物海绵交联度降低，吸水性增加，体外降解率增加，细胞毒性明显降低。

复合生物海绵；交联剂；京尼平；戊二醛；生物学特性

要制备具有一定强度和韧性的复合生物海绵，交联方法和交联剂的选择十分重要。生物材料的交联可采用光氧化、紫外光辐射和重度脱水等物理交联法，也可用戊二醛（Glutaraldehyde）、京尼平(Genipin)、多聚环氧化合物和碳化二亚胺等化学试剂进行的化学交联。物理交联法交联度较低，且不均一。戊二醛是最先使用且最常用的一种交联剂，具有水溶性、双官能团和价格低廉等优点，缺点主要在于有相当强的细胞毒性，易使组织硬化、钙化。京尼平是最近开始研究的一种交联剂，可用其交联明胶、胶原等材料，是传统中药杜仲的活性成分之一，其最大优点在于毒性很低[1]。本文主要从交联度、细胞毒性、吸水性和降解性等方面考察戊二醛和京尼平对复合生物海绵性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖（脱乙酰度大于85%，台州康多海洋生物医药化工有限公司），海藻酸钠（青岛晶岩生物发展有限公司），胶原蛋白（北京嘉康源化学试剂有限公司），其它试剂均为市购分析纯；L929细胞株，本实验室冻存；MTT、胰蛋白酶和EDTA（均购自Sigma公司）；RPMI 1640培养液（Hyclone公司），戊二醛（glutaraldehyde, 国药集团上海化学试剂有限公司），京尼平（genipin, 日本和光纯药工业株式会社），三硝基苯磺酸（Sigma 公司）

FreeZone6-LABCONCO冻干机(美国)，电子天平(sartorius, 德国)，752 紫外分光光度计(上海生产)，POLYSTAT恒温循环水浴箱（美国），SHELLAB CO2培养箱(美国)，SKAN SPE全波长酶标测定仪(Thermo)，超净工作台(苏净集团安泰公司)，INSTRON-5565精密电子万能材料试验机(美国)。

1.2 复合生物海绵的制备

将壳聚糖溶于稀醋酸溶液配成胶状液，再将海藻酸钠和胶原蛋白分别溶于去离子水中，将三种胶状液按一定比例混合，再加入戊二醛或京尼平交联剂，搅拌均匀后倒入模板中，置4℃冰箱交联，冷冻干燥，加热固化即可。

1.3 交联度的测定

参照Ofner等[2]的方法，每组材料取8个样本，其中5个加入l mL 浓度为40 g／L的碳酸氢钠和l mL浓度为5 g／L的三硝基苯磺酸，在40℃下加热4 h后，再加3 mL浓度为6 mol／L的盐酸，在120oC 、15-17 psi高压灭菌器中放置l h。水解产物用5 mL水稀释，然后用乙醚萃取，从水相中提取5 mL液体，在热水浴中加热15 min，冷却到室温，再用15 mL水稀释，在346 nm 测吸光度值(A三硝基苯磺酸)。另取3个样本先加盐酸，然后再加三硝基苯磺酸，其余步骤与上述5个样品制备相同，测得吸光度取平均值作为对照(A对)。交联后吸光度值为：A交联后= A三硝基苯磺酸一A对。再取等量未加交联剂的复合生物海绵，用同样步骤测吸光度，得到交联前吸光度（A交联前)。交联度 = (A交联前一A交联后)／A交联前x100%。

1.4 吸水性测定

室温下将质量为W0的复合生物海绵置于生理盐水中浸泡10 min后取出，置于与水平面成45oC的玻璃平板上沥水1 min后称重W1，根据公式计算海绵的吸水百分率； War=[( W1-W0)／W0]×100% 。

1.5 细胞毒性试验

根据国家标准方法[3]按照l cm2／mL的比例用细胞培养液浸泡复合生物海绵，制备浸提液。浸提液经0. 22 μm 滤膜去菌后谓100 %浓度原液，稀释一倍后谓50 %浓度液，稀释两倍后谓25%浓度液。将对数生长期的L929 成纤维细胞用0.25 %胰酶消化，制成1 ×104个细胞/ mL的悬液，接种于3 块96 孔培养板，用RPMI1640培养液 (含10 %胎牛血清) 培养。共分为7组：培养液阴性对照1组，戊二醛交联的100%、50%和25%浓度3组，京尼平交联的100%、50%和25%浓，3组，每组8个复孔。每组各加溶液100 μL 后培养，于第2、4、7 天各取出一块培养板，去掉培养液，加入20 μl MTT液，继续培养6 h ，然后吸出液体，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，在酶标仪上测定490 nm 波长的吸光值。通过下式计算相对增殖率( Relative growth rate，RGR) ：RGR = 实验组吸光值/对照组吸光值×100 %。根据RGR 均值，按表1对细胞毒性进行评价[3]。

表1 细胞毒性评价标准Tab.1 Evaluation criterion of cytotoxicity

1.6 体外降解

先将烘至恒重(W0)的复合生物海绵分别置于35oC生理盐水中浸泡，于不同时间点取出，水洗，烘至恒重，称量(W1)，按降解率 =(W0-W1)/W0×100% 计算降解百分率。同样，将烘至恒重(W0)的复合生物海绵分别置于含溶菌酶 2400 u/mL 的生理盐水中，按上述相同的步骤测定复合生物海绵的酶促降解结果。

2 结果与讨论

2.1 交联度和吸水性

在壳聚糖、海藻酸钠和胶原蛋白的混合胶液中，按每克混合材料加1.25 mg剂量的戊二醛或京尼平交联剂，置4oC冰箱各交联24 h、48 h和72 h，冷冻干燥后加热固化数小时。测各种复合生物海绵的交联度和吸水性，其结果见表2。

表2 戊二醛和京尼平交联复合生物海绵的交联度和吸水性Tab.2 Degree of cross linking and hydroscopicity of bio-composite sponge linked by glutaraldehyde and genipin respectively

从表2可见，用两种交联剂制得的复合生物海绵，其交联度均随交联时间的延长而增加，但在每个时间段，用戊二醛交联的复合生物海绵其交联度均高于用京尼平交联的复合生物海绵。而无论是用戊二醛或是京尼平作交联剂，复合生物海绵的吸水性均随交联时间的延长而降低，且京尼平交联的复合生物海绵的吸水性明显优于用戊二醛交联的复合生物海绵。

2.2 细胞毒性

复合生物海绵的细胞毒性实验结果示于图1。无论是采用戊二醛或京尼平作为交联剂制得的复合生物海绵在细胞培养初期（2 d），它们的浸提液对细胞增值均有一定的抑制作用，尤其是戊二醛交联的复合生物海绵，按评价标准细胞毒性已达到1级。但随孵育时间的延长，这种对细胞增值的抑制作用逐渐减弱，到第7天，细胞的相对增值率已超过100%，细胞毒性为0级。另外，用京尼平交联的复合生物海绵，无论是在不同的浸提液浓度或不同的细胞孵育时间，其表现的细胞毒性均明显低于用戊二醛交联的复合生物海绵，尤其是在后期（7 d）。用京尼平交联的复合生物海绵，不仅对细胞的增值没有抑制作用，反而促进了细胞的增值（相对增值率已达到120%）。

图1 . 戊二醛和京尼平交联复合生物海绵细胞毒性测定结果Fig.1 The cytotoxicity of composite bio-sponge linked by glutaraldehyde and genipin

2.3 降解性

用戊二醛或京尼平交联的复合生物海绵在生理盐水中或含溶菌酶的生理盐水中的降解结果分别示于图2和图3。用两种交联剂制得的两种复合生物海绵的体外降解率均随时间的延长而增加，在生理盐水中浸泡4周后，用京尼平或戊二醛交联的复合生物海绵降解率分别为32.1%和28.4%；而在含溶菌酶的生理盐水中浸泡40 h后，两种复合生物海绵的降解率已分别达到36.7%和31.2%。可见，在两种情况下，用京尼平交联的复合生物海绵其降解率都略高与用戊二醛交联的复合生物海绵。

图2 . 复合生物海绵在生理盐水中的降解Fig.2 Degradation of composite bio-sponge in saline

图3 . 复合生物海绵的酶促降解（▼）：GP（▲）：GAFig.3 Degradation of composite bio-sponge promoted by enzyme

戊二醛（GA）是一种同型双功能交联剂，其两个醛基可分别与两个相同或不同分子的伯氨基形成Schiff碱，将两个分子以五碳桥连接起来。当GA在水溶液中与生物材料发生交联时，一方面GA单体的醛基与生物材料的氨基反应生成Schiff 碱形成分子内交联；另一方面，因在水溶液中发生醇醛缩合而生成的长链的戊二醛聚合物也与前述的氨基发生反应形成分子间交联[4]。GA 具有亲水和疏水的混合特性，可很快地渗入生物材料的水性介质内，故能在短时间内有效地交联材料。

京尼平(GP)是从栀子果实中提取的天然交联剂,它是一种环烯醚萜类化合物，具有羟基、羧基等多个活性官能团。其交联机制可能如下：GP 首先自发与自由氨基反应生成一个环烯醚萜的氮化物，随后经过脱水作用形成一个芳香族的单体，之后这一芳香族单体可能由于基于自由基反应的二聚作用而形成环状的分子间和分子内交联[5]。

据文献报道，戊二醛交联生物材料时需要1 d 时间，而京尼平交联生物材料时需要3 d才可达到较稳定的交联效果[6]，所以本研究考察了用两种交联剂分别交联1～3天后复合生物海绵的各种生物特性。

从实验结果可见，用戊二醛交联的复合生物海绵其交联度高于京尼平交联的复合生物海绵。而交联度越高，表明生物材料间形成的分子内或分子间交联比例就越高，由此引起的生物材料的收缩就越严重，进而使生物材料变得越僵硬，柔韧性和吸水性均下降[7-8]。

细胞毒性是反映材料生物相容性的重要指标。在本研究中我们发现虽然两种交联剂制得的复合生物海绵在细胞孵育初期对细胞的增值都有一定的抑制作用，但各时间段，戊二醛交联的复合生物海绵其细胞毒性均明显高于京尼平交联的复合生物海绵，这与两者的交联机理有关。戊二醛交联生物材料时是靠醛基和氨基生成Schiff 碱, 但Schiff 碱很不稳定，易发生可逆性反应。这些因Schiff 碱逆反应而生成的带活性醛基的中间体不停地从材料中浸出，致使用戊二醛交联的材料表现出较严重的细胞毒性反应[9]。而京尼平交联的复合生物海绵表现出的低细胞毒性，一方面是因为京尼平为天然交联剂, 其本身毒性就小；另一方面是因为京尼平形成的环形交联比戊二醛的网状交联更稳定, 使其固定交联的材料在实际应用时不易渗出未反应的京尼平，从而不产生细胞毒性反应[6]。

[1] Chen YS, Chang JY, Cheng CY, et al. An in vivo evaluation of a biodegradable genipin-crosslinked gelatin peripheral nerve guide conduit material[J]. Biomaterials 2005, 26: 3911-3918.

[2] Ofner CM, Bubnis WA. Chemical and swelling evaluations of amino group crossslinking in gelatin and modified gelatin matrices[J]. Pharm Res,1996, 13(12): 1821-1827.

[3] 中华人民共和国国家标准，GB/T 16886.5-2003,医疗器械生物学评价，第5部分：体外细胞毒性试验[S].

[4] Sung HW , Chang Y, Chiu YT, et al. Crosslinking characteristics and mechanical properties of a bovine pericardium fixed with a naturally occurring crosslinking agent[J]. J Biomed Mater Res, 1999, 47∶116-126.

[5] Fwu LM , Yu CT , Huang CL , et al. In vitro wvaluation of a chitosan membrane cross-linked with genipin[J]. J Biomater Sci Polym Edn, 2001, 12 (8)∶835-850.

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[9] Sung HW, Huang RN, Huang LL, et al, In vitro evaluation of cytotoxicity of a naturally occurring cross-linking reagent for biological tissue fixation[J]. J Biomater Sci Polym Ed. 1999, 10(1): 63-78.

抑菌铜推广联盟在沪成立

旨在为中国公共卫生安全带来更大保障的“抑菌铜推广联盟”于近日“2012上海国际五金展”期间正式宣布成立。该联盟是由国际铜业协会携手我国相关协会和供应链伙伴共同发起的，其目的在推动抑菌铜—这一世界上最有效的接触表面抑菌材料在医疗设备、家具和配件、家电行业中更广泛的应用，从而进一步提高中国公共卫生安全水平，会上由国际铜业协会向国内志高空调等10家企业颁发了“抑菌铜Cu+”标识使用授权证书。

抑菌铜是目前唯一获得美国环保署（EPA）抑菌性注册的固体材料，是在美国环保署登记注册的350多种铜及铜合金产品和材料的集合，抑菌铜能够24小时全天候抑制致病细菌生长，在两小时内杀灭其表面超过99.9%的（特定）细菌，从而满足不同用户对公共接触表面抑菌性的需求。

“抑菌铜Cu+”品牌由国际铜业协会首次带入中国，本次抑菌铜推广联盟的成立，标志着协会、企业、知名品牌将强强联手，共推“抑菌铜Cu+”品牌，致力于抑菌铜的推广和应用，为提高中国公共卫生的基础设施水平和卫生条件将起到推动作用。

（本刊讯）

The lnfluences of Cross-Linking Agent on the Composite Bio-Sponge

【Writers 】Li Donghong, Li Pengxi, Luo Juxiu, Huang Lu
State key laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury, the 2nd Department of Research institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China

composite bio-sponge, cross-linking agent, genipin, glutaraldehyde, bio-properties

R318.08

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2012.05.002

1671-7104(2012)05-0317-04

2012-05-10

创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室课题（SKLZZ201004）

李东红，E-mail: lqs_cqayahoo.com.cn

【 Abstract 】ObjectiveTo investigate the influence of cross-linking agents genipin and glutaraldehyde on the composite bio-sponge.MethodsThe composite bio-sponge was prepared with the technology of lyophillization. The degree of cross linking was determined using absorptiometry of trinitrobenzensulfonic acid; the cytotoxicity was tested by MTT assay; the degradation rate in vitro was valuated by lysozyme degradation.Results①The degree of cross linking of composite bio-sponge crosslinked using genipin and glutaraldehyde increased with the crosslinking time, and reached 26.43% and 54.63% respectively after crosslinking 3 d. ② The water absorption rate of composite bio-sponge crosslinked using genipin was better than that of crosslinked using glutaraldehyde. ③ In the initial stage of cells incubation, all extracts of composite bio-sponges crosslinked using genipin and glutaraldehyde inhibited the growth of the cells, and the inhibition decreased with the incubation time; but the cytotoxicity of composite bio-sponge cresslinked using glutaraldehyde was higher than that of crosslinked using genipin. ④ After soaking in saline for 4 weeks, the degradation rate of composite bio-sponge cresslinked using genipin or glutaraldehyde was 32.1% 和28.4%, respectively; however, after soaking in saline containing lysozyme for 40 h, the degradation rate of composite bio-sponge was 36.7% 和31.2%, respectively..ConclusionCompared with the composite bio-sponge crosslinked using glutaraldehyde, the degree of cross linking and the cytotoxicity of the composite bio-sponge crosslinked using genipin decreased; however, the water absorption rate and the degradation rate increased．