忍贝颗粒质量标准的研究

李树鹏，刘凤鸣，刘 永

忍贝颗粒由忍冬藤、浙贝母、鱼腥草等组成，具有清热解毒、宣肺化痰、益气平喘的功效，用于治疗急性支气管炎及慢性支气管炎急性发作期。忍冬藤为处方君药，具有清热解毒的功效［1］。为控制本品的质量，本文对制剂中的忍冬藤、贝母、黄芩、鱼腥草进行了薄层色谱定性鉴别，采用高效液相色谱法测定了制剂中绿原酸的含量，为该制剂的质量控制提供分析方法。

1 试药与仪器

仪器:LC-10AT vp 型高效液相色谱仪(单元泵，SPD-10Avp 检测器，N2000 化学工作站)。电子天平(上海天平仪器厂);KQ-300DE 型超声提取仪(昆山市超声仪器有限公司)。试药:绿原酸(含量测定用，批号:110753－200413)，购自中国药品生物制品检定所，甲醇为色谱纯(Fisher Chemicals)，水为重蒸馏水，其余所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱法定性鉴别

2.1.1 忍冬藤的薄层鉴别［2］取本品5 g，加50 ml 水使溶解，加氢氧化钠试液调节pH 至7.0，加三氯甲烷洗2 次，每次20 ml，弃去三氯甲烷液，水溶液用水饱和正丁醇提取2 次，每次20 ml，合并正丁醇提取液加氨水洗2 次，每次30 ml，弃去氨试液，正丁醇提取液蒸干，残渣加甲醇1 ml 使溶解，作为供试品溶液。取忍冬藤对照药材2 g，加水50 ml，加热回流1 h，过滤，放冷，同法制成对照药材溶液。另取缺忍冬藤样品5 g，同法制备，作为阴性对照液。吸取上述3 种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1.8 mol/L 硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图1。

2.1.2 鱼腥草的薄层鉴别［3］取本品5 g，加50 ml 水使溶解，用氢氧化钠试液调节pH 至10.0，用乙酸乙酯60 ml 分2次提取，合并2 次乙酸乙酯提取液，蒸干至约1 ml，作为供试品溶液。另取鱼腥草对照药材2 g，加水50 ml，加热回流1 h，滤过，滤液用氢氧化钠试液调节pH 至10.0，同法制成对照药材溶液。另取缺鱼腥草样品5 g，同法制备，作为阴性对照液。吸取上述3 种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。见图2。

2.1.3 黄芩的薄层鉴别［4］取本品5 g，研细，加乙酸乙酯-甲醇(3:1)的混合溶液30 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml 溶解，作为供试品溶液。取缺黄芩样品5 g，同法制备，作为阴性对照溶液。另取黄芩苷对照品加甲醇制成每1 ml 含1 mg 的溶液制成对照品溶液，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图3。

2.1.4 浙贝母的薄层鉴别［5］取本品5 g，研细，加氨水2 ml搅拌，加三氯甲烷40 ml，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷lml 使溶解，作为供试品溶液;另取浙贝母对照药材粉末2 g，同法制成对照药材溶液;取缺浙贝母样品5 g，同法制备，作为阴性对照液。照薄层色谱法(2005 版药典附录VIB)试验，吸取上述3 种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水(17:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图4。

图1

图2

图3

图4

2.2 绿原酸含量测定［6-7］

2.2.1 溶液的制备 供试品溶液的制备:精密量取本品2 g，置25 ml 量瓶中，加50%甲醇至刻度，超声处理(功率250 W，频率30 kHz)30min，放冷，摇匀，以0.45 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。(1)阴性对照溶液的制备:按处方比例并参照本品制备工艺，配制不含忍冬藤的阴性样品，同法处理，制备成阴性供试品溶液，备用。(2)对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 ml中含绿原酸40 μg 的溶液，即得。

2.2.2 色谱条件 依利特色谱柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-水-冰醋酸(28:72:0.5)为流动相;流速为1.0 ml/min;进样量为10 μl;理论板数按绿原酸峰计算应不低于3 000。绿原酸对照品溶液、供试品溶液、缺忍冬藤阴性对照溶液的高效液相色谱图(见图5)。阴性对照品溶液在与对照品溶液相同保留时间位置上无吸收峰。

2.2.3 线性关系考察 依据“2.2.2”项下色谱条件，以自动进样器精密吸取浓度为0.04 mg/ml 的绿原酸对照品溶液4 μl、8 μl、12 μl、16 μl、20 μl，依次注入高效液相色谱仪，测定绿原酸色谱峰面积，以绿原酸的进样量为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，进行回归分析，得到回归方程为A =5 ×106C－5024.5，相关系数r=0.9997。结果表明，在上述色谱条件下，天麻素进样量在0.16～0.80 μg 范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度实验 精密吸取浓度为0.04 mg/ml 的绿原酸对照品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，测定，重复进样5次，测定峰面积。RSD = 0.2% ，结果表明仪器精密度良好。2.2.5 稳定性实验 吸取“2.2.1”项下制备的供试品液，按上述色谱条件，每隔4h 测定1 次绿原酸色谱峰面积，考察供试品液在24 h 内的稳定性，结果分别为214 284，221 794，213 450，216 555，213 988，210 695.RSD=1.75%(n=6)，结果表明，供试品液的绿原酸色谱峰面积在24 h 内基本稳定。

2.2.6 重现性实验 取本品(批号090220)研细，取约2 g，平行5 份，精密称定，按照“2.2.1 ”项下方法制得供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件，精密吸取10 μl 注入高效液相色谱仪，测定绿原酸的含量，测得本品每克含绿原酸分别为0.467，0.486，0.482，0.486，0.485 mg，即绿原酸平均含量为0.481 mg/g，RSD=1.68%(n=5)。结果表明，该实验操作重现性好，符合要求。

2.2.7 回收率实验 采用加样回收法。取已测知绿原酸含量的样品(批号090220)研细，绿原酸含量为0.486 mg/g，取约0.5 g，平行6 份，精密称定，分别精密加入浓度为0.8 mg/ml 的绿原酸对照品溶液3 ml，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件测定，求得平均回收率为99.6% ，RSD =0.96% ，结果见表1。结果表明，该实验方法测定绿原酸含量准确度合格。

2.2.8 样品测定 连续6 批样品按上述方法制备样品溶液，分别精密量取样品溶液和对照品溶液各10 μl 注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算含量，结果见表2。

图5 高效液相色谱图

表1 绿原酸回收率试验结果

表2 样品含量测定结果

3 讨论

忍冬藤为常用中药，具有清热解毒，疏风通络的功效。绿原酸为忍冬藤药材的主要有效成分，所以我们对绿原酸进行了薄层鉴别和含量测定。在绿原酸供试品溶液的制备中，先后考察了不同的提取溶剂(甲醇、75%甲醇和50%甲醇)、不同提取方法(超声、加热回流)、不同的超声时间(15 min，30 min，45 min)对绿原酸含量测定的影响，最后选定供试液制备方法为50%甲醇加热超声提取30 min。在选择流动相时，笔者也曾采用过甲醇－水(28:72)、甲醇－水(40:60)、甲醇－水－冰醋酸(28:72:0.5)，结果以甲醇-水-冰醋酸(28:72:0.5)分离效果较理想，可使制剂中绿原酸达到基线分离。本法能够较好地控制忍贝颗粒中绿原酸的含量，可作为控制该产品质量的指标。

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