肝癌中转化生长因子(TGF)-β信号转导通路的研究进展

朱宏斌，杨云生，郭明洲

中国人民解放军总医院消化科，北京 100853

肿瘤细胞周围的微环境对肿瘤的发生、发展和转移起着非常重要的作用。肿瘤微环境主要包括细胞和非细胞两大类成分，在肝癌组织中前者主要包括肝星状细胞、成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞等;后者则主要是上述细胞释放到肿瘤间质中的各种因子，包括胞外基质蛋白、蛋白水解酶、生长因子和各种炎症因子。这些非细胞成分通过影响肿瘤信号通路调节肿瘤的各种生物学行为。其中，转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)对肝癌的发生起着双向调节的作用，是目前研究的一大热点，本文就该方面的研究进展作一概述。

1 TGF-β信号转导通路

转化生长因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)是一个庞大的家族，脊椎动物TGF-β超家族包括 TGF-β、激活素(activins)、抑制素(inhibins)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)。哺乳动物 TGF-β 共有三种:TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3，研究发现，三种亚型由不同的基因编码，虽然具有相似的生物活性但其基因的表达具有明显的组织及发育特异性，其中肝脏含量最高且具有生物活性的TGF-β1。TGF-β1作用复杂，广泛参与哺乳动物的各种病理生理过程，影响细胞的增殖分化，在创伤愈合、胚胎发育、细胞外基质的形成、骨改建、免疫调节、神经系统的发育以及肿瘤的发生、发展等过程中发挥作用。

TGF-β1在肿瘤中主要参与刺激细胞生长，诱导细胞凋亡和分化，抑制天然免疫以及基质代谢的精细调节等活动。TGF-β可以通过Smad依赖通路和非Smad依赖通路发挥作用。TGF-β1信号通过激活受体TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ丝氨酸/苏氨酸激酶活性，使受体激活Smad(R-Smad)磷酸化，R-Smad与共同型Smad(Co-Smad)形成复合体，信号传递到细胞核内。细胞核内Smads寡聚体结合DNA和相关的转录因子调控靶基因的表达。R-Smad和Co-Smad可以在胞浆和细胞核间穿梭。抑制型Smad(I-Smad)可阻断受体磷酸化R-Smad，启动泛素化作用，受体复合物降解，这样抑制了信号的传导。STRAP可以稳定TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ与I-Smad形成的复合体，EGF受体和其他酪氨酸激酶受体的活化都可以诱导I-Smad的表达，抑制TGF-β信号转导。普遍认为该通路的激活与TGF-β发挥肿瘤抑制作用有关。此外，还有非Smad依赖通路，尽管其机制尚不明确，但一般认为这些通路的激活单独或者联合Smad依赖通路肿瘤抑制作用的缺失可以发挥促进肿瘤发展的作用。活化的受体复合物形成后，可以激活 PI3K/Akt、Rho/Rac GTPases、Ras/MAPK 和TAK1/MEKK1等非Smad依赖通路。TAK1(TGF-β激活的激酶1)可以介导TGF-β激活不同的MAP激酶通路，如JNK、P38等。TGF-β也可以诱导Cdc42 GTPase以及PP2A的活化而发挥非Smad依赖通路的生长抑制作用［1-2］。

2 TGF-β与肝细胞肝癌(HCC)的关系

2.1 TGF-β在肝脏炎症及纤维化中的作用 慢性肝炎及相关的肝纤维化和肝硬化是肝细胞发生恶性转化的主要因素，并且涉及到肝脏中所有种类的细胞。就肝癌发生的病理生理学而言，肿瘤微环境释放的因子产生持续、失衡的生长刺激，有利于恶性细胞和癌前细胞的选择性生长。最初，发生转化细胞在各种因子的作用下逃避机体免疫系统的监视，之后局部血管生成可以形成特定的微环境为肿瘤生长提供足够的营养，免疫细胞和肌成纤维细胞合成并分泌的基质金属蛋白酶降解脉管基底膜则利于肿瘤细胞跨越屏障。肝脏中各种细胞被激活后才能募集炎症相关的免疫细胞，而各种生长因子和促炎介质促进了肝细胞结构和功能损害。普遍认为TGF-β1是肝脏中一个重要的促纤维化因子，参与了肝脏纤维化的所有关键步骤［3］。在正常人的肝脏中无TGF-β1的转录和表达，而在部分肝切除后，肝组织的各种细胞均可检测到 TGF-β的转录［4］。在胆管结扎诱导的肝损伤模型中，只在肝星状细胞中检测到了TGF-β的表达［4］。在纤维化结节沿着纤维化隔膜的基质中，检测到了TGF-β1的表达，而从正常到发生硬化的肝组织都不表达TGF-β1，同时肿瘤结节转录和表达大量的TGF-β1［5］。胞外基质中的TGF-β1是以无活性的latent形式存在，可以被肿瘤微环境中富含的MMP-2、MMP-9激活，并结合于TGF-βRⅡ启动信号转导。TGF-β的表达在纤维化的肝脏中显著上升，可能诱导星状细胞的增殖和胶原的产生，它诱导肝星状细胞(HSC)的增殖需要激活JNK通路，研究表明JNK通路的广泛抑制剂可以抑制PDGF、TGF-β和血管紧张素Ⅱ诱导的肝星状细胞活化，并减弱PDGF和TGF-β信号通路的活性［6］。结缔组织生长因子(CTGF)可以介导TGF-β的活化，参与HSC介导的肝脏纤维化［7］。更重要的是，近来的研究发现TGF-β导致的纤维化作用因病因而异，说明TGF-β在不同的慢性肝脏疾病中不是一个通用的促纤维化因子，对临床标本的检测发现TGF-β主要参与HBV感染相关的肝纤维化，而HCV感染相关的肝纤维化主要与IL-13有关，并在某些病例中，还有其他的因子参与该过程［8］，为抗纤维化治疗提出了新的问题。

2.2 TGF-β在HCC中的作用及其调控 TGF-β在正常细胞癌变初期可作为抑癌因子抑制细胞增殖、启动细胞分化或凋亡，而在肿瘤晚期失去对某些癌细胞的抗增殖作用，而刺激血管生成、抑制免疫反应、促进ECM(extra cellular matrix)形成，为肿瘤细胞的快速生长、转移提供良好的局部环境，成为促进因子［9］。其作用在不同的组织中，不同的环境下截然不同，肿瘤细胞主要通过两种方式逃避TGF-β的肿瘤抑制作用，一是灭活该通路上的关键分子，如受体、R-Smad、Co-Smad，影响整个通路的活性，已经在结肠和胰腺肿瘤中发现了 TGF-β RⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad4 的突变;二是某些肿瘤只对TGF-β诱导的细胞抗增殖作用选择性地逃避，而保留TGF-β的促进分裂、侵袭、转移等功能，如高表达Myc蛋白，Akt或Ras/MAPK通路活性的异常增高，以及稳定TGIF分子，促进FoxG1、Ski/SnoN、Evi-1 的表达，高表达 Smad7 等抑制因子［10］，而高水平的端粒酶逆转录酶(TERT)也能阻止TGF-β的增殖抑制作用［11］。上皮间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是多细胞生物胚胎发生发育过程中的基础过程，也存在于多种慢性疾病(如肾纤维化)及肿瘤的转移过程中。上皮细胞具有极性并通过细胞间的桥连而紧密相连，从而防止细胞的迁移。相反，间质细胞间没有稳定的连接，且具有收缩和运动的能力。在EMT的过程中，上皮细胞失去彼此间的连接，同周围细胞分离并获得间质细胞样特征，从原发部位游离。EMT的发生涉及多个环节，包括(1)启动因子(如TGF-β、HGF等);(2)信号转导通路;(3)转录因子(Twist、snail、ZEB、Wnt)等。TGF-β 可以刺激从上皮细胞和间充质前体细胞中产生具有高度运动能力的肌成纤维细胞，后者存在于肿瘤基质中，可以促进癌细胞的增殖、肿瘤的侵袭和形成新生血管［12-13］。此外，TGF-β与肿瘤细胞的远处转移有关，这种作用在不同肿瘤及肿瘤发展的不同阶段有明显的差异。在肿瘤晚期，如 TGF-β 促进肿瘤转移［14］、TGF-β/Smad 通路介导乳腺癌骨转移等［15］，而在结肠癌肝转移模型中，稳定表达TGF-β抑制因子Smad7也可以促进肝脏转移灶的形成［16］。

与胰腺癌和结肠癌不同，HCC很少发生TGF-β受体和Smad蛋白的灭活性突变，而且HCC细胞高表达并且分泌 TGF-β［17］，这些都提示在HCC中肝细胞有完整的TGF-β通路，通过改变下游分子而使TGF-β通路仅仅失去细胞增殖抑制作用［18］。HBx蛋白激活Ras/丝裂原活化的蛋白激酶途径，包括胞外信号调节激酶和JNK导致细胞增殖，TGF-β可以激活TGF-βRⅠ和c-Jun N端激酶(JNK)，它们分别通过磷酸化Smad3 C-末端区域(pSmad3C)和中间linker(pSmad3L)而传递信号，表达HBx的肝细胞可以在肿瘤抑制和肿瘤形成间进行可逆性转变，提示 Smad3的 C-端区域(pSmad3C)磷酸化传输一种肿瘤抑制TGF-β信号，而Smad3链接器区域(pSmad3L)磷酸化促进了肝脏的纤维化及癌细胞的侵袭性，并且能抑制Smad3C的磷酸化［19-20］。对临床标本的检测进一步表明，在肿瘤发生的早期，HBx蛋白将肝细胞的TGF-β信号转导途径上抑制性通路转变为对肿瘤有促进作用的通路，并认为评估HBV感染的标本中的pSmad3C和pSmad3L有助于评价HCC发生的风险［21］。Matsuzaki等通过对有HCV感染史的肝炎、肝硬化、肝癌患者进行检测，进一步验证了上述结论，他们发现肝细胞中pSmad3L/PAI-1的增加伴随着肝纤维化和坏死性炎症的发展以及pSmad3C/p21(WAF1)的减少，这一过程与肝癌的发生明显相关，而IL-1β激活JNK通路参与了这种转换，从而认为HCV感染导致慢性炎症能使肝细胞中TGF-β的肿瘤抑制作用转变为促纤维化作用，增加HCC发生的风险［22］。另有文献报道，tristetrapolin启动子区特定位点的甲基化，影响了它对c-myc的转录后修饰，导致肝癌细胞中c-myc水平的异常增高，TGF-β不能产生肿瘤抑制作用而成为促进肿瘤形成的因素［23］。其他肿瘤存在类似的现象，如 disabled homolog 2(DAB2)在头颈部鳞癌细胞中以及PDGF-B在恶性胶质瘤细胞中的表达变化均能影响这些细胞对TGF-β肿瘤抑制作用的敏感性［24-25］。上述研究表明肝癌细胞以不依赖于灭活TGF-β/Smad通路关键分子的方式选择性地耐受TGF-β的抗细胞增殖作用。

TGF-β能够促进HCC细胞发生EMT，Giannelli等报道肝癌组织中胞外基质蛋白Laminin-5、Snail和Slug的表达明显高于癌旁组织，E-cadherin的表达低于癌旁组织，发生EMT的肝癌细胞E-cadherin的表达下降。当Laminin-5单独作用于肝癌细胞时，后者表现出部分EMT的特征，而与TGF-β的共同作用使肝癌细胞发生完全EMT，认为微环境中细胞因子的变化可以成为肿瘤生物治疗的靶点［26］。TGF-β也能诱导胎肝细胞发生EMT，此时，细胞高表达Snail、E-cadherin表达下降，细胞表达间充质蛋白并发生肌动蛋白骨架重排［27］。TGF-β调控着HCC细胞与肿瘤基质间的交互作用，将肌成纤维细胞与恶性转化的肝细胞共同移植小鼠明显促进肿瘤生长，干扰PDGF通路后，E-cadherin和beta-catenin的表达及分布都无变化，从而阻断了HCC 细胞发生 EMT［28］。

3 以TGF-β为基础的肝癌诊断和靶向治疗

HCC患者血液及尿液中TGF-β的浓度较健康人群明显上升，并与 HCC的恶性程度和预后明显相关［29-30］。多数研究结果都认为在 HCC患者中分析TGF-β水平是可行的，并且有助于预后分析。为了提高TGF-β在预后分析中的价值，可以联合应用其他蛋白标志，如与 AFP联合以提高预测的准确性［31］。Okumoto等研究发现HCC患者血浆中TGF-β浓度大于10 ng/mL者预后较差，反之则预后较好［32］，Dong等则发现肝脏TGF-β1的表达与HCC的分化程度和HBV的复制状态有关，HCC组血清中TGF-β1及TGF-β1 mRNA的水平明显升高，并且TGF-β1达到1200 ng/mL时，对HCC诊断的敏感性和特异性分别达到89.5%和 94%，与 AFP联合应用，其检出率可达97.4%，对于HBV相关HCC的诊断和治疗有重要意义［30］。但这种检测仍有不足之处，重要的一点是得到的数值不稳定，一方面是由于疾病本身的异质性，另一方面在样品的回收和检测中难免混杂血小板来源的TGF-β［29-33］。

肝癌的治疗方案以手术切除为首选，对于不能切除的肝癌，有些需要进行系统治疗，但是可以选择的药物较少，典型药物是多靶点抑制剂索拉非尼，其抗血管生成作用是目前改善HCC患者生存率的主要途径，许多新靶向药物都是血管生成抑制剂。肝脏的纤维化是肝细胞发生恶性转化的一个阶段，但是针对纤维化及延缓HCC发生的药物却很少，鉴于TGF-β在肝脏纤维化中的重要作用，其抑制剂可能成为HCC治疗的新途径。目前，这类靶向药物主要包括特异性的抑制剂和非特异性的抑制剂。非特异性的抑制剂有halofuginone、trichostatin、lenalidomide 以及其他的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，他们可以抑制包括TGF-β在内的多条信号通路。特异性的TGF-β抑制剂主要通过3种方式发挥作用:①用反义寡核苷酸(ASO)在蛋白翻译水平抑制，如AP-12009;②用单克隆抗体抑制配体/受体的结合，如 Lerdelimumab(CAT-152);③ 用 TGF-β 受体激酶抑制剂作用于受体介导的信号转导，如LY-573636已进入Ⅱ期临床［1］。已有30多种特异性靶向药物进入临床研究［34］，但在肝癌中的研究较少。

HCC是我国常见的恶性肿瘤，绝大多数HCC都有肝硬化基础，确诊时已多属中、晚期，缺乏有效治疗，预后差。虽HCC非手术疗法有所进展，但手术切除仍是目前最有效的治疗方法。晚期HCC切除后复发率高，易转移，早期诊断与靶向治疗极为重要。TGF-β在胚胎发生发展、肝细胞生长和分化过程中起重要作用，与肝癌的发生、发展密切相关，TGF-β在癌变早期起抑制作用，进展期则失去这种作用，对其机制的深入研究可能为HCC早期诊断、疗效及预后判断提供新的评价指标。

［1］Massague J.TGF beta in cancer［J］.Cell，2008，134(2):215-230.

［2］Zhang YE.Non-Smad pathways in TGF-beta signaling［J］.Cell Res，2009，19(1):128-139.

［3］Dooley S，Weng H，Mertens PR.Hypotheses on the role of transforming growth factor-beta 1 in the onset and progression of hepatocellular carcinoma［J］.Dig Dis，2009，27(2):93-101.

［4］Bissell DM，Wang SS，Jarnagin WR，et al.Cell-specific expression of transforming growth factor-beta in rat liver:Evidence for autocrine regulation of hepatocyte proliferation ［J］.J Clin Invest，1995，96(1):447-455.

［5］Bedossa P，Peltier E，Terris B，et al.Transforming growth factor-beta1(TGF-beta1)and TGF-beta1 receptors in normal，cirrhotic，and neoplastic human livers［J］.Hepatology，1995，21(3):760-766.

［6］Kluwe J，Pradere JP，Gwak GY，et al.Modulation of hepatic fibrosis by c-Jun-N-terminal kinase inhibition ［J］.Gastroenterology，2010，138(1):347-359.

［7］Gao R，Brigstock DR.Connective tissue growth factor(CCN2)induces adhesion of rat activated hepatic stellate cells by binding of its C-terminal domain to integrin alpha(v)beta(3)and heparan sulfate proteoglycan［J］.J Biol Chem，2004，279(10):8848-8855.

［8］Weng HL，Liu Y，Chen JL，et al.The etiology of liver damage imparts cytokines transforming growth factor beta1 or interleukin-13 as driving forces in fibrogenesis［J］.Hepatology，2009，50(1):230-243.

［9］Padua D，Massagué J.Roles of TGF beta in metastasis［J］.Cell Res，2009，19(1):89-102.

［10］Seoane J.Escaping from the TGF beta anti-proliferative control［J］.Carcinogenesis，2006，27(11):2148-2156.

［11］Geserick C，Tejera A，González-Suárez E，et al.Expression of mTert in primary murine cells links the growth-promoting effects of telomerase to transforming growth factor-beta signaling ［J］.Oncogene，2006，25(31):4310-4319.

［12］Allinen M，Beroukhim R，Cai L，et al.Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer ［J］.Cancer Cell，2004，6(1):17-32.

［13］De Wever O，Mareel M.Role of tissue stroma in cancer cell invasion［J］.J Pathol，2003，200(4):429-447.

［14］Letterio JJ.Disruption of the TGF-beta pathway and modeling human cancer in mice［J］.Mutat Res，2005，576(1-2):120-131.

［15］Kang Y，He W，Tulley S，et al.Breast cancer bone metastasis mediated by the Smad tumor suppressor pathway［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(39):13909-13914.

［16］Halder SK，Rachakonda G，Deane NG，et al.Smad7 induces hepatic metastasis in colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2008，99(6):957-965.

［17］Matsuzaki K，Date M，Furukawa F，et al.Autocrine stimulatory mechanism by transforming growth factor beta in human hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2000，60(5):1394-1402.

［18］Dooley S，Weng H，Mertens PR.Mertens，hypotheses on the role of transforming growth factor-beta in the onset and progression of hepatocellular carcinoma［J］.Dig Dis，2009，27(2):93-101.

［19］Sekimoto G，Matsuzaki K，Yoshida K，et al.Reversible Smad-dependent signaling between tumor suppression and oncogenesis［J］.Cancer Res，2007，67(11):5090-5096.

［20］Yoshida K，Matsuzaki K，Mori S，et al.Transforming growth factorbeta and platelet-derived growth factor signal via c-Jun N-terminal kinase-dependent Smad2/3 phosphorylation in rat hepatic stellate cells after acute liver injury ［J］.Am J Pathol，2005，166(4):1029-1039.

［21］Murata M，Matsuzaki K，Yoshida K，et al.Hepatitis B virus X protein shifts human hepatic transforming growth factor(TGF)-beta signaling from tumor suppression to oncogenesis in early chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2009，49(4):1203-1217.

［22］Matsuzaki K，Murata M，Yoshida K，et al.Chronic inflammation associated with hepatitis C virus infection perturbs hepatic transforming growth factor beta signaling，promoting cirrhosis and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2007，46(1):48-57.

［23］Sohn BH，Park IY，Lee JJ，et al.Functional switching of TGF-beta1 signaling in liver cancer via epigenetic modulation of a single CpG site in TTP promoter［J］.Gastroenterology，138(5):1898-1908.

［24］Hannigan A，Smith P，Kalna G，et al.Epigenetic downregulation of human disabled homolog 2 switches TGF-beta from a tumor suppressor to a tumor promoter［J］.J Clin Invest，120(8):2842-2857.

［25］Bruna A，Darken RS，Rojo F，et al.High TGFbeta-Smad activity confers poor prognosis in glioma patients and promotes cell proliferation depending on the methylation of the PDGF-B gene［J］.Cancer Cell，2007，11(2):147-160.

［26］Giannelli G，Bergamini C，Fransvea E，et al.Laminin-5 with transforming growth factor-beta1 induces epithelial to mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2005，129(5):1375-1383.

［27］Caja L，Bertran E，Campbell J，et al.The transforming growth factorbeta(TGF-beta)mediates acquisition of a mesenchymal stem cell-like phenotype in human liver cells［J］.J Cell Physiol，2011，226(5):1214-1223.

［28］van Zijl F，Mair M，Csiszar A，et al.Hepatic tumor-stroma crosstalk guides epithelial to mesenchymal transition at the tumor edge［J］.Oncogene，2009，28(45):4022-4033.

［29］O'Brien PJ，Ramanathan R，Yingling JM，et al.Analysis and variability of TGFbeta measurements in cancer patients with skeletal metastases［J］.Biologics，2008，2(3):563-569.

［30］Dong ZZ，Yao DF，Yao M，et al.Clinical impact of plasma TGF-beta1 and circulating TGF-beta1 mRNA in diagnosis of hepatocellular carcinoma［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7(3):288-295.

［31］Song BC，Chung YH，Kim JA，et al.Transforming growth factor-beta1 as a useful serologic marker of small hepatocellular carcinoma［J］.Cancer，2002，94(1):175-180.

［32］Okumoto K，Hattori E，Tamura K，et al.Possible contribution of circulating transforming growth factor-beta1 to immunity and prognosis in unresectable hepatocellular carcinoma［J］.Liver Int，2004，24(1):21-28.

［33］Baselga J，Rothenberg ML，Tabernero J，et al.TGF-beta signallingrelated markers in cancer patients with bone metastasis［J］.Biomarkers，2008，13(2):217-236.

［34］Nagaraj NS，Datta PK.Targeting the transforming growth factor-beta signaling pathway in human cancer［J］.Expert Opin Investig Drugs，2010，19(1):77-91.