原发性肝癌早期诊断特异分子标志物的研究进展

姚登福，姚 敏，蔚丹丹，严晓娣，陈 洁

南通大学附属医院临床医学研究中心，江苏 南通 226001

原发性肝癌(primary hepatocarcinoma，PHC)的防治是全世界的医学难题，近半数的肝癌病例在我国，已是仅次于肺癌的常见恶性肿瘤。肝癌形成是多基因异常、多阶段发展的复杂过程。已报道的与PHC诊断相关的标志物众多，其中血AFP为应用最广泛的诊断标记物，但单纯以AFP诊断PHC已难以满足临床需要，且敏感性和特异性均难令人满意［1-2］。随着基因组学、蛋白组学、转录组学等多种“组学”技术的发展，越来越多的与肝细胞恶性转化相关分子如肝癌特异性蛋白被发现，可明显改进PHC诊断特异性;发现肝癌相关基因转录异常，可监测PHC微小转移［3-4］。本文就PHC早期诊断特异标志的研究进展作一述评。

1 分子诊断基础

PHC是由病毒、化学致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些癌基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控而致癌变，其中数百种基因调控和表达与肝癌发生、发展相关［5-6］。从PHC发生发展过程中基因表达谱分析，为探讨肝癌多基因参与的复杂过程提供了新的途径，以揭示肿瘤的发生机制，或作为早期诊断、分子分型、疗效和预后判断的依据。肝癌模型证实，鼠肝28000个基因表达谱在肝细胞发生恶性转化早期，约有3000个基因上调，近300个基因上调幅度大于8倍;主要涉及细胞周期、炎症相关的信号转导、肿瘤转移、凋亡抑制和抑癌基因等［7］。

伴随肝细胞的恶性转化，蛋白表达谱发生异常改变。蛋白质组学在研究肝癌发生机制、寻找肝癌诊断的特异性标记物和治疗靶点等方面已进行了一些有意义的探索。随着该项技术改进，相信会有灵敏、经济、快捷方法用于临床，以提高肝癌早期诊断的阳性率。以表面增强的激光解析电离飞行时间质谱(SELDITOFMS)分析良、恶肝病患者血清蛋白谱型，对PHC诊断特异性蛋白筛选有一定价值，蛋白标志的灵敏度和特异度较高，操作简单，正确率优于AFP［8］。

2 肝细胞恶性转化相关蛋白

2.1 HS-AFP 以亲和层析原理，从总AFP中分离出的HS-AFP(或称AFP-L3)，占血清总 AFP的10%左右，是PHC患者血中最主要的AFP异质体;HS-AFP增加反映HCC的恶性程度，被认为是PHC早期特异诊断的潜在分子标志;HS-AFP定量的临床资料显示，对肝癌诊断的特异性大于 95%［9-10］;在慢性 HBV/HCV或肝硬化患者，如HS-AFP异常，高度提示该患者可能是PHC高危人群，需要加强监测;HS-AFP比影像学检查早9～12个月检测出肝硬化患者中的早期PHC。

2.2 HS-GGT HS-GGT是从总GGT分离出对肝癌诊断具有特异性的胚胎型部分(Ⅰ’、Ⅱ、Ⅱ’)，对PHC诊断的敏感性在85%左右，早期诊断价值不亚于AFP。对AFP假阴性肝癌(＜50 g/L)和小肝癌的诊断率分别为84.0%、78.6%(AFP仅为50%)。与 AFP浓度或肿瘤大小无明显相关［11］。通过多项标志物的筛选，认为HS-GGT可作为AFP以外的最佳肝癌标志物。GGT-mRNA可望成为检测肝细胞早期癌变的灵敏方法。肝GGT基因可分为3种亚型:即胎肝(F)、胎盘(P)和肝癌细胞(H)亚型，其中H亚型阳性可能为肝细胞的癌前期病变。

3 肝细胞相关生长因子

3.1 胰岛素样生长因子亚组分(IGF-Ⅱ) 肝脏发育过程中IGF-Ⅱ基因以启动子、甲基化程度、印迹状态等进行动态调节。肝脏是合成和分泌IGF-Ⅱ的主要器官，在肝细胞癌变过程中胚胎型IGF-Ⅱ基因活化，激活已关闭的启动子P3而产生胚胎表型逆转，使IGF-Ⅱ过表达，经IGF-Ⅰ受体上酪氨酸激酶途径合成与活化。肝细胞恶性转化过程中，IGF-Ⅱ呈进行性增加。肝癌发生早期IGF-Ⅱ异常并伴有脉管区卵圆细胞的出现，免疫组织化学证实小肝癌中可见IGF-Ⅱ呈强阳性表达，高达40～100倍;另外IGF-Ⅱ与PHC分化程度有关，低分化肝癌中见强阳性表达。IGF-Ⅱ表达异常与肝病患者病情严重程度有关，肝癌和部分癌旁组织中表达，而远癌组织不表达［12-13］。

3.2 转化生长因子-β 亚组分(TGF-β1)TGF-β1 是TGF-β家族的成员，是一种与正常和变异细胞生长和分化的调节有关的多功能细胞因子，具有强大而可逆的生长抑制活性以及免疫抑制作用。TGF-β1为一种多功能生长因子，在胚胎发生发展、肝细胞生长和分化过程中起重要作用，与肝癌发生、发展密切相关［14］。肝癌模型的动态研究发现在诱癌过程中，随着肝细胞癌变发生，肝细胞总浆蛋白浓度变化不明显，但TGF-β1表达进行性升高;肝细胞癌前病变组已明显高于正常对照组;肝细胞癌变组活性达高峰。小分子TGF-β1极易释放入血，因此血TGF-β1也显著增加，且两者呈明显的正相关，提示PHC是TGF-β1高表达肿瘤，TGF-β1可能参与肝细胞癌变过程，浓度的进行性升高可反映肝细胞的早期癌变。

3.3 血管生成素亚组分(Ang-2) 血管生成是PHC生长、进展的关键步骤。PHC为血供丰富的恶性肿瘤，多种细胞因子过表达。Ang主要由血管内皮细胞和血管周围细胞合成，经自分泌作用与细胞膜上酪氨酸激酶受体(Tie)-2特异结合，但不引起受体磷酸化和随后的信号传递。Ang主要由 Ang-1和Ang-2组成，是维持血管内皮细胞稳定及促进血管重构，促血管新生的血管生成因子，Ang-2与肝癌发生关系最为密切［15］。肝细胞发生癌变过程中，肝Ang-2呈进行性动态表达。肝病患者血Ang-2水平，急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化患者较低，肝癌患者较高，随肝病进展呈进行性增加，与VEGF呈显著正相关(r=0.769);如以血Ang-2＞35 ng/mL为界，肝癌组95%异常，Ang-2过表达有助于肝癌的诊断与鉴别。

3.4 血管内皮生长因子(VEGF) 新血管生成是肝癌生长、侵袭和转移的基础，是癌细胞播散的途径，促进血管渗漏。VEGF表达调控较为复杂，突变的ras癌基因可使VEGF表达增强，而ras表达抑制物可显著降低VEGF活性;突变的P53基因可增强蛋白激酶活性，以诱导VEGF表达，保持肿瘤无限制侵袭性生长，癌组织须依赖持续广泛的新生血管形成;VEGF与血管内皮细胞膜两种酪氨酸激酶受体结合发挥作用，具有促进不同来源内皮细胞分裂、增殖和血管构建的作用，并促进内皮细胞、单核细胞的迁移。诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子，诱导血管形成;同时并参与促进细胞增殖的信号传递，与炎症介质间具有良好相关性，以自分泌或旁分泌而相互作用。VEGF能激活癌血管内皮细胞增殖，可作为肝癌血管生成的早期标志［16］。

4 膜蛋白与肝癌

4.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖亚组分(肝癌特异组分，GPC-3)GPC-3在PHC发展过程中过表达，位于胞质和胞膜，癌旁定位于胞质，而远癌肝组织未见表达。且癌GPC-3强度高于癌旁和远癌肝组织，与HBV感染相关，HBsAg阳性组高于阴性组，与AFP联检可提高诊断率。GPC-3过表达与基质金属蛋白酶(MMP)2、FGF2、FGFR1、FGFR2、硫酸酯酶 1(SULF1)和SULF2显著相关，GPC-3是一种分泌型糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白，半数PHC患者血中可测到GPC-3，而肝硬化、慢性肝炎和健康人血中未测出。GPC-3表达与瘤体大小有关，肝癌＜3.0 cm组明显高于≥3.0 cm组，中、低分化癌组织GPC-3阳性率明显高于高分化肝癌，过表达肝癌预后差［17-18］。

4.2 高尔基蛋白亚组分(GP-73)GP-73是存在于细胞高尔基体的一种跨膜蛋白，是病毒感染的肝细胞内具有正调节作用的固有高尔基蛋白。GP-73在健康人群和非肝病患者中GP-73水平低，HBV携带者GP-73水平虽高于健康者和非肝病患者，但远低于肝癌患者。肝癌患者GP-73水平是HBV携带者的20倍。早期PHC诊断，GP-73敏感性明显高于AFP。GP-73主要由胆管上皮细胞表达，深入研究发现无论何种原因引起的肝病，患者GP-73水平均显著上调。非肝病患者和正常人GP-73水平相近;GP-73诊断肝癌的敏感性为76.9%，特异性达92.8%，与肿瘤大小和分级未见确切关系。GP-73具有应用前景，尚须更多病例证实和长期随访，以及了解GP73在其他肝脏占位性病变中的表达等。肝癌患者血GP-73显著升高，早期诊断肝癌的诊断优于AFP，而GP-73异质体的敏感性和特异性则高达90%、100%，可能是肝癌可靠的诊断标志物［19-20］。

4.3 膜联蛋白A2(Annexins A2，ANXA2) 膜联蛋白是一个钙离子依赖的、阴离子的磷脂结合蛋白家族，故又称为钙磷脂结合蛋白。其家族已报道至少160种家族成员，且大多数都有重要的蛋白结合伴侣，最典型的代表就是ANXA2，其表达及蛋白翻译后异常修饰与肝癌的发生发展有着密切关系。鉴于ANXA2在正常肝组织、PHC癌旁和PHC癌组织表达差异显著，可将ANXA2作为肝细胞癌标志物。免疫组化分析ANXA2表达，并结合其他肝癌标志物(GPC-3和Hsp70)，可增加PHC诊断准确性，灵敏度74%，特异性100%;ANXA2作为新生血管敏感而特异性标志，加入已经建立的诊断标准，使肝活检诊断 PHC更可靠。血ANXA2浓度与光密度在0～10 μg/mL范围内呈线性关系，最低检出敏感性是0.02 μg/mL。用于临床显示PHC病人血ANXA2浓度明显高于正常对照，可为PHC 诊断灵敏标志［21］。

5 外周血相关基因转录异常

5.1 微RNA(miRNA)表达谱改变 miRNA是由21～25个核苷酸构成的非编码小分子RNA，通过翻译抑制或降解靶mRNA在转录后水平调控基因表达。研究发现，miRNA在发育、细胞分化、增殖、凋亡、病毒感染以及癌变等多种病理生理过程中起着重要的作用。肝细胞癌是世界范围内的常见恶性肿瘤，最新的研究表明miRNA直接参与肝细胞癌的发生、发展，且与肝细胞癌的诊断、转移和预后等相关。Ura等以RT-PCR扩增分析了HBV和HCV相关PHC组织的188个miRNAs，发现 has-miR-122a、-199和-223等17种低表达，与上调肿瘤相关途径如细胞周期、黏附、蛋白质转录和翻译有关;6种中高表达如 has-miR-21、98、221、222等，与下调抗肿瘤免疫等有关，miRNAs表达谱在肝癌早期诊断具有应用前景［22-23］。

5.2 IGF-Ⅱ mRNA 在肝癌发生过程中，胚胎型IGF-Ⅱ mRNA重新表达，IGF-Ⅱ表达上调。肝组织IGF-Ⅱ表达，受4个启动子(P1～4)调控，其中胚胎型P3启动子活化是导致IGF-Ⅱ持续表达，细胞增殖以致形成肝细胞癌的重要驱动因素，且其过高表达与P3和P4启动子的再激活及P1启动子失活高度相关。肝癌患者外周血 IGF-Ⅱ mRNA阳性率为34.2%，当将IGF-Ⅱ的临界值定为4.1 mg/mL时，诊断小肝癌的敏感性为63%，特异性为90%，提示IGF-Ⅱ是小肝癌和PHC早期诊断的敏感血清标记物［13］。

5.3 TGF-β1 mRNA TGF-β1 mRNA 在肝细胞恶性转化时进行性增高，肝癌形成时达高峰，是PHC发生、发展的分子标记。肝癌组织、癌旁组织和外周血中TGF-β1 mRNA 阳 性 率 分 别 为 100%、46.2% 和53.3%;Ⅲ期肝癌为83.3%，高于Ⅰ期和Ⅱ期肝癌，TGF-β1和TGF-β1 mRNA可成为PHC早期检测的敏感标记物。血TGF-β1诊断PHC的敏感性为74.4%，特异性为77.9%，与 AFP联检阳性率达95.5%;对AFP阴性PHC及小肝癌的诊断阳性率也可达85.7%［14］。尿中 TGF-β1 水平与 PHC 显著相关，对AFP阴性或低浓度PHC的诊断有较高价值。

5.4 GPC-3 mRNA GPC-3 mRNA在非肝细胞肝癌组织内均不表达，故认为GPC-3 mRNA在AFP阴性肝癌中特异性表达，可作为PHC的新基因标志。免疫组化显示PHC中阳性率为72%，正常肝和良性肝病未检测到。另HCC患者血中可检到GPC-3可溶性NH2-末端片段(sGPC-3)，将sGPC-3作为早期PHC的血清学标记物。GPC-3过表达与肝细胞恶性转化相关，肝癌模型显示从肝细胞颗粒样变性、不典型增生(癌前期)及癌形成时，肝GPC-3 mRNA转录水平及GPC-3梯度表达呈正相关，与组织学一致，过表达是肝细胞恶性改变的早期事件［18］。

6 展望

肝癌的手术切除仍是治疗的首选方法。肝癌的恶性程度极高，早诊早治和术后复发监测是提高患者存活率的唯一途径。肝癌形成是多基因异常、多阶段发展的复杂过程，已报道的与肝癌诊断相关的标志物众多，单纯以AFP诊断肝癌，其敏感性和特异性均难令人满意［24-25］。近来质谱、基因表达谱、蛋白质组学、肿瘤免疫等相关技术的应用，已筛选出一些潜在的具有诊断特异性的标志物，如HS-GGT、HS-AFP和GPC-3等。肝细胞恶性转化发生、发展关键信号通路的阐明将为肝癌的诊断带来新的契机。多种具有诊断特异性标志物的联合应用，可有效提高肝癌诊断的敏感性及特异性，也利于AFP阴性或低浓度肝癌的早期发现。

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