丹皮酚对大肠癌细胞端瞄聚合酶的影响

夏士涛，谭诗云，朱卫芳，刘长青

1.武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060;2.荆门市第一人民医院消化内科

1998年Smith等利用TRF1(端粒重复序列结合因子1)在酵母双向杂交实验诱导而发现的一种新的端粒相关蛋白－端锚聚合酶(TRF1-interacting ankyrin related ADP-ribose polymerase，Tankyrase)［1］，其主要功能之一是通过对TRF1的糖基化修饰调节端粒长度，在肿瘤的发生过程中起作用［2］，Tankyrase1有望成为继端粒酶后，对细胞的生长、衰老、癌变起极其重要作用的调控因子［3-4］。前期研究发现丹皮酚具有体外抗大肠癌细胞的作用［5］，然而丹皮酚对大肠癌细胞Tankyrase1表达的影响目前尚不十分清楚，本研究对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 人结肠癌:HT-29细胞株购自中南大学肿瘤研究所，正常人结肠细胞:NCM460细胞系购自汉恒生物科技(上海)有限公司。

1.1.2 主要试剂:丹皮酚注射剂:上海第一制药厂(10 mg/2 mL，批号:990402)，临用前用 RPMI 1640培养液稀释成终浓度为3.91～250 mg/L;RPMI 1640培养基:美国GIBCO公司产品;小牛血清:杭州四季青生物材料研究所提供;琼脂粉:武汉亦新生物技术有限责任公司;胰酶:武汉亦新生物技术有限责任公司;逆转录反应缓冲液:Promega，Oligo(dT)18上海生工生物工程技术服务有限公司，dNTPmix华美生物工程公司;RNase inhibitior:华美生物工程公司;Taq酶:上海赛百盛生物技术有限公司;PCR反应缓冲液:上海赛百盛生物技术有限公司;50 bp GeneRuler DNA Ladder:上海赛百盛生物技术有限公司，100 bp GeneRuler DNA Ladder:上海赛百盛生物技术有限公司;TBE缓冲液:DecentBio。引物:Tankyrase1上游引物5'－CTCTCCTGGCTGTTCTTTGG －3'，下游引物 5'－ATCGGGCACTCGTCTGTAAC －3'，PCR产物长度为188 bp，由上海赛百盛基因技术有限公司合成特异性内参β-action:上游引物5'－GCGCTCGTCGTCGACAACGG －3'，下游引物5’－GTGTGGTGCCAAATCTTCTCC －3'，PCR 产物长度为238 bp，由上海赛百盛基因技术有限公司合成。

1.1.3 主要仪器设备:PCR基因扩增仪(PTC100/PE9700):Biometra，电泳仪:上海复日科技有限公司;电泳成像拍照(EDAS290):Vilber Lourmat，PCR primer design software(Primer 5):PREMIER Biosoft International，UV-1700 pharmaspec UV-visible spectrophotometere:SHIMADZU。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:将正常大肠细胞和HT-29细胞培养在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，加人青霉素100 u/L，链霉素100 u/L，置37℃，5%CO2培养箱内培养，每3～4 d用0.25%胰酶消化传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 实验分组:有正常大肠细胞和大肠癌细胞两种细胞株，分别给两种细胞株加入不同浓度的丹皮酚，以加入等量的细胞培养液为对照组，这样实验分成四组:第一组为大肠癌细胞，第二组为加入丹皮酚的大肠癌细胞，第三组为正常大肠细胞，第四组为加入丹皮酚的正常大肠细胞。丹皮酚的浓度分度分别为3.91 mg/L、7.81 mg/L、15.63 mg/L、31.25 mg/L、62.5 mg/L、125 mg/L、250 mg/L，对每一组培养24 h、48 h、72 h、96 h后分别提取总mRNA。

1.2.3 总 RNA的提取:取培养瓶中的细胞液置入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，冰上剧烈震荡混匀;将溶液置于室温5 min，以彻底降解核蛋白产物，加预冷的0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置5 min;4℃离心，12000 r/min×15 min，仔细吸取上层水相，移至另一新EP管，加入0.4 mL冰冷异丙醇，充分混匀后室温放置10 min，4℃离心，12000 r/min×10 min，弃上清，加入冰冷的75%乙醇0.8 mL，混匀洗涤RNA 10 min，4 ℃离心，10000 r/min×3 min，弃上清，管口敞开，室温干燥RNA 10 min，使乙醇挥发;加入20 μL DEPC处理的无菌水，枪头轻轻混匀几次，55～60℃孵育20 min以溶解RNA。

1.2.4 RNA纯度和浓度检测:比色皿用95%的酒精洗两遍，再用DEPC水洗两遍后加入3 mL DEPC水调零，再加入5 μL RNA混匀，应用UV 240型紫外分光光度仪测定核酸吸光度 A260和 A280值。计算A260/A280，其值应在 1.8～2.0之间，如果比值 ＞2.0，说明 RNA 可能降解;如果比值 ＜1.8，说明有蛋白质和DNA等杂质残留。按OD260=1时RNA含量约为40 μg/mL的标准计算RNA浓度。取A260/A280比值＞1.80者分为2 μL/管，－75℃保存备用。

1.2.5 逆转录反应:引物OD值为10D，短暂离心后用无菌双蒸水溶解稀释为10 pmol/μL，小量分装储存于－75℃冰箱。由细胞株提取的总RNA两步法扩增DNA目的片断。RT反应(20 μL体系):DEPC处理过的无菌0.2 mL薄壁 EP管置于冰上，其中混合:总RNA(0.5 μg/μL)2 μL;Oligo(dT)18 Primer(0.5 μg/μL)1 μL;DEPC 水7 μL;轻轻混匀，离心 5 s;将混合物置于70℃下5 min，迅速置于冰上冷却，短暂离心;将混合物置于冰上，并依次加入下列试剂:5×Buffer 4 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;RNase inhibitor(20 u/μL)1 μL混匀，稍离心，将混合物置于37℃下5 min;向混合物加入 MMLV(200 u/μL)1 μL，终体积为 20 μL，上PCR仪，在42℃孵育60 min逆转录;再放入70℃孵育10 min以终止反应;并在4℃保温，防止二级结构形成;并分装2 μL/管，－20℃保存备用。PCR反应:无菌0.2 mL薄壁EP管，依次加入以下试剂:cDNA 1.5 μL;上游引物(10 pmol/μL)1 μL;下游引物(10 pmol/μL)1 μL;10 × Buffer 2.5 μL;Mg2+(20 mmol/L)1.5 μL;dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL;无菌双蒸水 14 μL;Taq 酶 (1 u/μL)1 μL;终体积为 25 μL;反应条件:预变性95℃ 10 min，变性95℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，一共循环45次;72℃5 min终止反应，最后4℃保存，－20℃冰箱保存待测。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳:加5 μL PCR反应产物及1 μL溴酚蓝于点样孔，电泳50～80 V(5 V/cm)，20 min，将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于EDAS290电泳成像仪中拍照并用Kodak1D 3.5专用软件进行图像分析，记录结果。Tankyrase1的相对表达量分别以其PCR产物的A值与β-actin PCR产物A值之比计算。

1.2.6 RNA 凝胶电泳:取1 μL 的总 RNA 在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，确定RNA的质量和完整性。真核细胞的28S/18S的比值约为2∶1，如果比值逆转，则表明RNA降解。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计。实验数据以表示，单一两组均数之间进行t检验，多组间均数以方差分析(ANOVE)进行组间比较，均数之间的多重比较以SNK进行q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA测定结果 本实验抽提的四组细胞中总RNA，电泳结果可见清晰的28S、18S和5S条带，说明所提取的总RNA样本无降解，质量良好。

2.2 RT-PCR的结果 经RT-PCR扩增后Tankyrase1基因转录本片段大小为与理论值相符。

实验结果表明:(1)RT-PCR扩增的Tankyrase1 cDNA产物(目的基因与内参拷贝数的比值)在大肠癌细胞中的表达(0.875±0.037)比在正常对照组升高(0.1532 ±0.108)(P ＜0.05)，而在给予丹皮酚干预后的Tankyrase1(0.356 ±0.018)表达较下降(P ＜0.05)，但在正常大肠细胞组(0.1532 ±0.108)与正常细胞加丹皮酚组中(0.2379±0.012)并未出现这种显著性的改变(P＞0.05)。丹皮酚在15.63～250 mg/L浓度范围内对HT-29细胞中Tankyrase1 mRNA的表达有影响。

3 讨论

近年多种研究表明非甾体类抗炎药(NSIADs)如阿司匹林等能减少人类和实验动物大肠癌的发生［6］，但长期应用时不良反应较多，最常见的是胃肠道反应，可出现胃溃疡或胃出血，因而限制了其在临床上的广泛使用。

丹皮酚为中药牡丹皮的主要活性成分，药理研究表明，牡丹皮的有效成分具有与非甾体类抗炎药相似的药理作用［7-8］，如解热镇痛、抗炎、免疫调节、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中枢抑制作用等，且其副作用小，在临床上可大剂量使用。

本实验研究发现，丹皮酚在3.91～250 mg/L的4个浓度下，在 3.91 mg/L浓度下大肠癌细胞中Tankyrase1 mRNA表达与未加丹皮酚组相比，无显著性差异(P＞0.05)，后三者与未加丹皮酚组相比，有显著性差异，且有明显的浓度效应和时间效应关系。推测在丹皮酚作用下，大肠癌HT-29细胞的Tankyrase1 mRNA表达下调，已发生二磷酸腺苷核化的TRF1去糖基，再次恢复与端粒与端粒DNA结合的能力，使端粒处于“结合”状态，当与端粒DNA结合的TRF1到一定数目时，这个数目取决于丹皮酚的浓度和作用时间，达到临界数时，就抑制调节端粒长度的“蛋白计数”机制从而抑制端粒酶端粒，端粒延长终止。

［1］Smith S，Giriat I，Schmitt A，et al.Tankyrase，a Poly(ADP-Ribose)Polymerase at Human Telomeres［J］.Science，1998，282(11):1484-1487.

［2］Ancelin K，Brunori M，Bauwens S，et al.Targeting assay to study the cis functions of human telomeric proteins:evidence for inhibition of telomerase by TRF1 and for activation of telomere degradation by TRF2［J］.Mol Cell Biol，2002，22(5):3474-3487.

［3］Chen H，Li Y，Tollefsbol TO.Poly(ADP-ribose)polymerase inhibitors:new pharmacological functions and potential clinical implications［J］.Curr Pharm Des，2007，13(9):933-962.

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［5］Liu CQ，Tan SY，Ji CY，et al.The effects of paeonol on inhibiting the proliferation of human colorectal cancer cell line HT-29 and its molecule mechanism ［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2005，21(10):1251-1524.刘长青，谭诗云，计春燕，等.丹皮酚对大肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用及其机制的探讨［J］.中国药理学通报，2005，21(10):1251-1254.

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