盐酸头孢替安酯的聚合物检查方法的建立与验证

褚 良，张 哲

(辽宁省盘锦市食品药品检验所，辽宁盘锦124010)

盐酸头孢替安酯(Cefotiam hexetil hydrochloride)为半合成第2代口服头孢菌素类广谱抗生素头孢替安的酯化物，最早由日本武田药业研制成功并上市。本品自身并无抗菌作用，口服后在肠道粘膜迅速水解为头孢替安(CTM)被吸收而起效，因此其有效成分为头孢替安。头孢替安对革兰阳性和阴性菌的抗菌活性与以往口服的头孢菌素相同，而且对β－内酰胺酶稳定。盐酸头孢替安酯可用于对本品敏感的葡萄球菌、肺炎球菌、嗜血流感杆菌所引起的咽喉炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、毛囊炎、淋巴节炎、乳腺炎、中耳炎等［1－3］。盐酸头孢替安酯不良反应发生率约为3.6%，主要有腹泻或软便、呕吐、腹痛、皮疹等。其属于β－内酰胺类抗生素，大量实验和研究表明，β－内酰胺类抗生素引起的速发型过敏反应与其含有的聚合物有关(有些还与药物的毒性反应有关［4］)。所以控制产品中聚合物含量是减少此类抗生素过敏反应的重要途径之一［5］。目前β－内酰胺类抗生素中聚合物的分析，主要是采用以葡聚糖凝胶G－10为天亮的凝胶色谱法［6－7］，但在日常实践中也发现G－10凝胶色谱柱存在柱效低、分离效果差等缺点［8］。且G－10凝胶色谱柱只能用水系统作为流动性，不能加入任何有机溶剂，对于一些不易溶于水的酯类抗生素无法进行分析。近年来高效分子排阻色谱(HPSEC)法逐渐成熟，并用于分析抗生素中的聚合物含量［9］，该方法更为准确、灵敏、简便易行，且其可以使用一定比例的有机溶剂作为流动性，因此应用范围更广，是凝胶色谱发展的必然趋势。本文参考了相关文献，通过方法学验证，建立了使用凝胶色谱柱(TSD G2500 PWxl)的HPSEC发分析盐酸头孢替安酯的聚合物，对此方法进行了方法学验证，并采用验证后的方法对盐酸头孢替安酯进行了检验，此方法检验盐酸头孢替安酯的聚合物可行。

1 仪器和试药

1.1 仪器:岛津2010A高效液相色谱仪

1.2 试药:盐酸头孢替安酯对照品(厂家提供);供试品为某药业提供的3批盐酸头孢替安酯(批号分别为:T111001，T111002，T111003);乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适用性试验:色谱柱为TSK G2500 PWxl凝胶柱(7.8 mm ×30 cm)(TOSOH Japan);流动相:pH7.0 的0.001 mol/L 磷酸盐缓冲液［0.001 mol/L的磷酸氢二钠溶液－0.001 mol/L的磷酸二氢钠溶液(61∶39)］一乙睛(80∶20);流速0.5 mL/min;检测波长为:254 nm;进样量为20 uL。取对照溶液，连续进样6次峰面积的相对偏差应小于2%。

2.2 对照品溶液的制备:取盐酸头孢替安酯对照品适量，精密称定，用少量乙腈溶解后加流动相定量稀释制成每1 mL中约含10 μg头孢替安的溶液，作为对照品溶液。

2.3 样品溶液的制备:取盐酸头孢替安酯样品适量，精密称定，用少量乙腈溶解后加流动相定量稀释制成每1 mL中约含1 mg头孢替安的溶液，作为样品溶液。

2.4 测定法:精密量取新配制的样品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图;另精密量取对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。将盐酸头孢替安酯前的杂质峰计为聚合物峰，按外标法以峰面积计算，含盐酸头孢替安酯聚合物以头孢替安计。

3 方法学考察

3.1 对照品线性关系:精密称取盐酸头孢替安酯对照品30.13 mg，用乙腈溶解后分别加流动性稀释制成含头孢替安1.03 μg/mL、5.15 μg/mL、10.30 μg/mL、15.45 μg/mL、20.60 μg/mL的溶液，分别精密量取上述溶液各20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。峰面积分别为:1297、6341、12382、19139、25842。以头孢替安的浓度对峰面积作线性回归，得回归方程为:Y=1552.2X －158.01，r=0.9998。结果表明:进样浓度在1.03 μg/mL ～20.60 μg/mL 范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

3.2 对照品重复性

3.2.1 对照品溶液主峰的重复性:照“2.2”项下方法，取对照品溶液，连续进样6次，主峰面积分别为13765、13748、13692、13729、13801、13867.RSD=0.44%。重复性良好，可满足检验要求。

3.2.2 对照品溶液F值测定重复性:精密称取盐酸头孢替安酯对照品约30 mg，共6份，精密称定，用少量乙腈溶解后加流动性定量稀释制成每1 mL中含头孢替安10 μg的溶液，分别精密量取6份对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。峰面积(A)与对照品称样量(W)的比值(校正因子F)有良好的重复性(见表1)，符合检验要求。

表1 对照品溶液校正因子日内重复性

3.3 对照品溶液的稳定性:照“2.2”项下方法，取对照品溶液，室温放置 8 h，分别于 0、1、2、4、8 h 精密量取对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。主峰峰面积分别为13865、13816、13901、13787、13791，RSD=0.36%。对照品溶液室温8 h内稳定，可满足检验要求。

3.4 聚合物线性关系:分别精密称取样品适量(批号:T111001)置量瓶中，用少量乙腈溶解后加流动性分别稀释制成每 1 mL 含头孢替安 0.10 mg、0.52 mg、1.03 mg、1.55 mg、2.06 mg的溶液，分别精密量取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。聚合物峰面积分别为:337、1798、3451、5103、6933。以头孢替安的浓度对聚合物峰面积作线性回归，得回归方程为:Y=3334.6X+19.913，r=0.9998。结果表明:进样浓度在0.10 mg/mL～2.06 mg/mL范围内，浓度与聚合物峰面积呈良好的线性关系。

3.5 聚合物峰F值测定重复性:精密称取盐酸头孢替安酯样品(批号:T111001)约30 mg，共6份，精密称定，用少量乙腈溶解后加流动性定量稀释制成每1 mL中含头孢替安1 mg的溶液，分别精密量取6份样品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。聚合物峰面积(A)与样品称样量(W)的比值(校正因子F)有良好的重复性(见表2)，符合检验要求。

表2 聚合物峰F值测定重复性

3.6 样品溶液的稳定性:照“2.3”项下方法，取样品溶液，室温放置 8 h，分别于 0、1、2、4、8 h 精密量取样品溶液 20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。聚合物峰面积分别为3398、3584、3794、4077、5218，RSD=17.90%。样品溶液室温 8 h内不稳定，聚合物增加，因此样品溶液应临用新制。

3.7 盐酸头孢替安酯定量限:以信噪比10∶1为指标，测得颜色头孢替安酯的定量限以头孢替安计为0.66×10－5mg/mL。3.8 样品聚合物的测定:照“2”项下方法测定3批样品(批号分别为:T111001，T111002，T111003)聚合物的含量分别为0.21%，0.20%及 0.23%。

4 讨论

4.1 色谱柱的选择:建立上述测定方法时，同时考虑了Sephadex G－10和TSK G2500 PWxl两种色谱柱。本品为酯类化合物，在水中溶解时形成胶状体，不能完全溶解在水中，再向其中加入大量磷酸盐缓冲液时形成絮状的沉淀，但溶液中如果有一定比例的有机溶剂存在时就不会发生上述情况。由于Sephadex G－10色谱柱只能用水系统作为流动性，不能用有机溶剂，而上述形态的样品进到色谱柱中只能使色谱柱阻塞，无法进行样品分析，因此无法使用Sephadex G－10。而TSK G2500 PWxl色谱柱可用一定比例的有机溶剂，因此样品可以很好的分散在溶剂中，可以进行样品分析。同时TSK G2500 PWxl柱分离的分子量范围广，柱效高，分析时间短，能在高效液相色谱仪上使样品与聚合物实现良好的分离，分离度大于1.5，且峰形对称，因此选择了 TSK G2500 PWxl柱进行本品聚合物的分离检测。

4.2 流动性的离子强度、pH值及流速的选择:流动性的离子强度、pH值及流速可以影响样品中聚合物与主峰的分离度。同时考虑到样品在缓冲盐系统中的溶解性。最终选择流动性的盐浓度为 0.001 mol/L、pH 值为 7.0、流速为0.5 mL/min。

4.3 有机相比例的选择:由于盐酸头孢替安酯的高分子杂质分子量大小不一，且流动相中不含有机相时样品溶解度不好。但加入一定量的有机相后可改善样品溶解度同时聚合物共流出形成单个色谱峰。分别将流动相中0.005 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液和乙睛的比例设为70∶30、80∶20和90∶10进行实验，结果表明:当流动相比例为90∶10时聚合物可见多个色谱峰，当有机相比例增大为80∶20及70∶30时聚合物共流出形成单个色谱峰，头孢替安酯与其聚合物实现有效分离。但由于有机相比例大时可能会缩短色谱柱的使用寿命，同时为了方便分析定量，因此选择有机相比例为80∶20。

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［7］ 胡昌勤，金少鸿，孙学兰.离子对凝胶色谱法分离头抱菌素中高分子杂质［J］.中国抗生素杂志，1990，15(5):357.

［8］ 胡昌勤，孙学兰，金少鸿.离子对凝胶色谱分离头孢菌素中高分子杂质实验条件的选择［J］.中国抗生素杂志，1991，16(4):276.

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