哌仑西平对近视鸡眼巩膜基质MMP－2和TIMP－2表达的影响*

戴淑真， 张 黎， 王丽娅， 曾骏文

(1河南省眼科研究所，河南郑州450003;2中山大学中山眼科中心，广东广州510060)

最近研究发现选择性M1受体阻断剂哌仑西平能有效抑制近视的发生发展［1］，与传统的近视防治药物阿托品相比，哌仑西平无瞳孔扩大、调节麻痹以及抑制唾液分泌和胃肠蠕动等副作用，因此将哌仑西平作为防治近视的新药研究更具有临床意义。但目前哌仑西平抑制近视的作用机制仍不明确。本研究拟采用玻璃体内注射哌仑西平的方法观察哌仑西平对鸡眼形觉剥夺性近视的疗效及对近视鸡眼巩膜纤维层基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP－2)及其抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP－2)表达的影响。

材料和方法

1 主要试剂与仪器

哌仑西平(Sigma)，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，明胶(Sigma)，PCR扩增仪 PE9700(ABI)，凝胶扫描仪系统 GDS7600 (ABI)，Phototope－HRP Western blotting检测试剂盒(Cell Signaling)，分光光度计(Shimadzu UV3000)，游标卡尺(上海量具刃具厂)，冷冻离心机(Heraeus Biofuge 22R型)，Mini－Protein垂直平板电泳仪(Bio－Rad)，直流稳压电泳仪(Bio－Rad)，垂直平板微电泳槽(Bio－Rad)。

2 动物分组、近视模型建立及用药方案

将1日龄纯种M99穗麻雄鸡40只随机分为正常对照组、单纯遮盖组、药物对照组和哌仑西平组，每组10只。所有动物均以右眼为实验眼，左眼不作任何处理，其中后3组小鸡的右眼用直径为15 mm的半透明试管底遮盖。药物对照组和哌仑西平组的遮盖眼分别每天玻璃体内注射0.01 mol/L磷酸盐缓冲液和1%哌仑西平磷酸盐缓冲液，玻璃体内给药使用100 μL微量进样器将上述液体50 μL注入玻璃体内。每天下午6时给药。这2组动物的眼罩用直径为7 mm的环钻开窗，以便用药。在鸡眼平面的光照度保持在40 Lux，光照周期12 h∶12 h。1% 哌仑西平溶液为盐酸哌仑西平粉剂1 g加0.01 mol/L磷酸盐缓冲液至100 mL制成，pH值为4.0。注射前用0.5%丁卡因局部麻醉，注射后结膜囊内滴0.3%妥布霉素眼液。

3 检测指标

3.1 验光与眼外径的测量 形觉剥夺5 d后进行验光、测量眼轴长度和赤道部直径。验光由2位有经验的专业验光师完成，验光值取两者的平均值。预实验表明，双盲下2位验光师关于小鸡眼的验光值相关性为0.928(n=24)。验光结果一律采取鸡眼水平轴的屈光度，检影镜光束与小鸡头部矢状面夹角在60°左右。验光后断头法处死小鸡取得眼球，用游标卡尺测量眼球外径，包括眼球轴长和赤道径，测量2次后取平均值，精确度0.02 mm。测量完成后用7 mm的环钻钻取后极部巩膜，在解剖显微镜下小心剥离巩膜纤维层，进行下列检测。

3.2 RT－PCR反应检测MMP－2和TIMP－2 mRNA 采用Trizol一步法抽提鸡眼巩膜纤维层的总RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴别RNA的抽提情况，根据引物设计的原则，设计合成MMP－2、TIMP－2和内参照β－actin的引物(见表1)，进行RTPCR反应，反应结束后行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外光下立体成像。

表1 MMP－2、TIMP－2和β－actin引物设计Table 1 .Primers of MMP－2，TIMP－2 and β－actin

3.3 Western blotting检测MMP－2和TIMP－2蛋白

采用抽提缓冲液匀浆提取鸡眼巩膜纤维层的蛋白质，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，SDS－PAGE，全湿电转移，免疫印迹反应，反应结束后的PVDF膜沥干后保鲜膜包裹，暗室内X光胶片放在PVDF膜上，曝光15 s～20 min，取出X光胶片，进行显影、定影处理，冲洗，晾干，底片照相。以甘油醛－3－磷酸脱氢酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase GAPDH)作为内参照。

3.4 明胶酶谱法检测MMP－2的活性 电泳前的处理步骤同3.3。电泳结束后将凝胶转移入0.3% SDS溶液中低速摇动漂洗 15 min，再转入2.5% Triton X－100中摇动45 min，取出凝胶浸入明胶酶反应液中，37℃、18 h，然后转入5%考马斯亮蓝R250染色液中染色1 h，脱色液脱色至看到明显的负染带，蒸馏水漂洗，照相。

4 统计学处理

所有图像均经KONTRON IBAS 2.0全自动分析系统对条带扫描半定量分析。数据用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，SPSS 17.0统计软件包进行处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 屈光状态与眼轴长度

各组动物实验结束时眼球屈光度、眼轴长度和赤道径的测量结果见表2。哌仑西平治疗组较单纯遮盖组和药物对照组鸡眼屈光度分别减少了5.71 D和5.88 D，眼轴长度缩短了3.25 mm和2.24 mm，赤道径减少了1.51 mm和1.47 mm，均有显著差异(P＜0.05)。单纯遮盖组与药物对照组比较各项指标无显著性差异(P＞0.05)，单纯遮盖组和药物对照组与正常组相比，各项指标差异显著(P＜0.05)。哌仑西平治疗组与正常组相比，鸡眼呈相对近视，屈光度增加了8.85 D，眼轴长度和赤道径分别增加了2.71 mm和0.59 mm，差异显著(P＜0.05)。

表2 实验结束时各组眼球屈光度、轴长和赤道径的比较Table 2.Comparation of refraction，axial length，equatorial diameter of the eyes(±s.n=10)

表2 实验结束时各组眼球屈光度、轴长和赤道径的比较Table 2.Comparation of refraction，axial length，equatorial diameter of the eyes(±s.n=10)

*P＜0.05 vs normal control;#P＜0.05 vs form deprivation or vehicle control.

Group Refraction(D) Axial length(mm) Equatorial diameter(mm) Normal control 3.05±0.63 6.45±0.41 9.32±0.44 Form deprivation －11.52±1.27* 11.99±0.56* 11.42±0.49* Vehicle control －11.69±1.53 10.98±0.80 11.38±0.71 Pirenzepine injection －5.81±0.78*# 8.74±0.61*# 9.91±1.08*#

2RT－PCR检测MMP－2和TIMP－2 mRNA

巩膜纤维层所提取的总RNA进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳均可见18S和28S的电泳带。RTPCR结果显示，正常组鸡眼巩膜纤维层MMP－2和TIMP－2有一定程度的表达。半定量分析结果表明:MMP－2 mRNA的表达水平在单纯遮盖组较正常组升高155.24%(P＜0.01)，药物对照组与遮盖组相比无显著差异 (P＞0.05)，哌仑西平组较遮盖组和药物对照组分别降低50.96%和52.65%(P＜0.01)，见图1;TIMP－2 mRNA的表达水平在单纯遮盖组较正常组降低52.01%(P＜0.01)，药物对照组与遮盖组相比无显著差异 (P＞0.05)，哌仑西平组较遮盖组和药物对照组分别升高62.03%和58.31% (P＜0.01)，见图2。

Figure 1.The expression of MMP－2 mRNA.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.图1MMP－2 mRNA的表达

Figure 2.The expression of TIMP－2 mRNA.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.图2TIMP－2 mRNA的表达

3 Western blotting分析MMP－2和TIMP－2蛋白在各组鸡眼巩膜纤维层的表达

Western blotting半定量分析结果表明:MMP－2的表达水平在遮盖组较正常组升高149.21%(P＜0.01)，药物对照组与单纯遮盖组相比无显著差异(P＞0.05)，而哌仑西平组较单纯遮盖组和药物对照组分别下降45.07%和46.17%(P＜0.01)，见图3; TIMP－2的表达水平在单纯遮盖组较正常组降低53.75%(P＜0.01);药物对照组与单纯遮盖组相比无显著差异(P＞0.05);而哌仑西平组较单纯遮盖组和药物对照组分别上升52.53%和42.52%(P＜0.01)，见图4。

4 明胶酶谱法检测MMP－2的活性

正常组鸡眼巩膜纤维层既有MMP－2的潜在形式(72 kD MMP－2)又有其活性形式(66 kD MMP－2)的表达。半定量分析结果表明:单纯遮盖组较正常组72 kD和66 kD MMP－2的活性分别升高58.72%和66.40%(P＜0.01);而哌仑西平组72 kD和66 kD MMP－2的活性较药物对照组分别降低16.76%和23.46%(P＜0.01);较单纯遮盖组分别降低21.67%和26.85%(P＜0.01);药物对照组与单纯遮盖组相比，两者的活性无显著差异(P＞0.05)，见图5。

Figure 3.The expression of MMP－2 protein.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.图3MMP－2蛋白的表达

Figure 4.The expression of TIMP－2 protein.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.图4 TIMP－2蛋白的表达

Figure 5.The changes of MMP－2 activity.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.图5MMP－2活性的变化

讨论

本研究在成功建立鸡眼形觉剥夺性近视模型的基础上，采用玻璃体内注射哌仑西平的方法部分抑制了近视的发生发展。关于用药剂量和时间的选择，参考有关文献及预实验结果，每天用50 μL 1%哌仑西平连续5 d，既保证了确切的疗效，又避免了药物过量引起的毒副作用［2］。我们的实验结果表明哌仑西平治疗组较药物对照组鸡眼屈光度减少了5.88 D，眼轴长度缩短了2.44 mm，赤道径减少了1.47 mm，统计学分析均有显著差异(P＜0.05)，这说明玻璃体内注射哌仑西平能有效抑制实验性近视的发生发展。本研究结果与Truong等［2］研究发现的哌仑西平能部分抑制近视基本一致，而与Tigges等［3］得出的哌仑西平能完全抑制实验性近视的结论有所不同。这可能与不同的实验动物、实验条件及用药时间有关。有趣的是，玻璃体内注射哌仑西平亦对眼球赤道径有一定的影响，这与阿托品只对眼球前后径有抑制作用不同［4］，我们认为这可能是由于两者在眼内的分布、作用位点或作用方式不同所致。

目前近视的发生机制尚不明确，长期以来人们认为过度调节是近视发生的关键因素;流行病学研究表明近距离工作与近视的发生发展关系密切［5］，并认为近距离工作引起的调节和辐辏作用使眼外肌对眼球产生张力，造成睫状肌痉挛，而睫状肌的收缩可以影响脉络膜，从而继发性造成巩膜紧张，二者均能使巩膜扩张，眼轴变长［5］。因此认为眼轴的伸长是一种被动的过程，即调节过度→机械压迫或牵引→近视发展。通过减弱调节，去除这种作用，可以阻止近视的发展。正视眼的动物佩戴凹透镜后能诱发眼球过度增长和近视的研究结果支持这种观点［6］。但近年来，尤其是实验性近视模型的建立以及生物分子水平等微观研究的深入，越来越多的研究对过度调节引起眼球被动伸长这一理论提出异议。用形觉剥夺或透镜去焦造成的实验性近视研究表明:在实验性近视中调节并不起主导作用，阿托品等调节麻痹药物是通过非调节机制阻止近视发展的［6］。临床上用阅读眼镜、接触镜和双焦眼镜不能成功减轻近视进展的事实支持这一观点［7］。越来越多的证据表明近视眼的调节并不像以往想像的那样过度甚至痉挛，而是相对低下和迟滞［7］。本研究结果显示选择性M1受体拮抗剂哌仑西平能有效抑制近视。由于眼虹膜和睫状体上主要是M3受体，故哌仑西平对调节幅度及瞳孔散大的影响极小，这进一步佐证了近视发生的非调节机制。

巩膜是一种致密的黏弹性结缔组织，无论是在出生后眼球的正常发育还是在近视眼的发展过程中，巩膜在决定眼球的形状和大小并进而影响眼球的屈光状态中均起着重要作用［4］。动物实验性近视眼和人类近视眼的巩膜均有胶原纤维的合成代谢减少而分解代谢增加，巩膜蛋白多糖的糖胺多糖合成和硫化减少［8］。巩膜组织的这种重新塑形需要其基质合成和降解之间的精细平衡，其中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和其组织型抑制剂TIMPs起着重要作用［9］。MMPs是一类高度保守的锌或钙依赖的肽链内切酶，依照酶解底物的不同分为4个亚族:基质胶原酶、明胶酶、基质降解酶、跨膜或膜型金属蛋白酶，它们均参予了巩膜ECM的重塑［10］，其中MMP－2是正常动物巩膜中的主要明胶酶，可以降解鸡眼巩膜纤维层及哺乳动物纤维巩膜的I型胶原，与近视的发生发展关系密切［9］。TIMPs是体内存在的MMPs的生物抑制剂，其中TIMP－2是MMP－2的特异抑制剂，它对MMP－2酶原及活性MMP－2均有抑制作用［9］。MMP－2/TIMP－2的平衡对巩膜ECM代谢起着重要调节作用。我们的研究结果显示形觉剥夺性近视鸡眼巩膜纤维层MMP－2 mRNA、蛋白及其酶活性升高，而TIMP－2 mRNA和蛋白水平下降，这导致了MMP－2/TIMP－2失衡，巩膜纤维层MMP－2的裂解活动增加，ECM分解代谢加强而合成代谢减弱［9］，巩膜变薄，眼轴增长而导致近视发生。有研究发现哌仑西平抑制近视的作用位点并不在视网膜，可能是通过直接作用于巩膜上的M1受体进而干预巩膜ECM的代谢而抑制近视的［2］。我们在以前的研究中发现哌仑西平治疗组较单纯遮盖组形成相对远视，后极部巩膜纤维层增厚，胶原纤维直径增粗，病理改变程度较单纯遮盖组明显减轻［11］。本研究结果显示哌仑西平组较单纯遮盖组巩膜纤维层MMP－2 mRNA和蛋白质表达及其活性均显著降低，而较正常组明显升高;TIMP－2的各项表达均较单纯遮盖组明显增高，而较正常组明显降低。可见哌仑西平可能通过抑制鸡眼巩膜纤维层MMP－2的表达及激活同时增强TIMP－2的表达。从而调节近视鸡眼后极部巩膜ECM的代谢，增加巩膜对眼内压的机械抵抗力，减慢眼球的扩张而部分抑制近视的。哌仑西平调节MMP－2和TIMP－2的具体途径尚不明确，可能与M受体结合后经直接或间接途径影响一系列生长因子如转化生长因子β (transforming growth factor β，TGF－β)［12］、视黄酸、碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblast growth factor，bFGF)和生物活性物质的代谢过程有关，这还需要进一步的研究。

［1］ Metlapally S，McBrien NA.The effect of pirenzepine on positive－ and negative－lens－induced refractive error and ocular growth in chicks［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(11):5438－5444.

［2］ Truong HT，Cottriall CL，Gentle A，et al.Pirenzepine af-fects scleral metabolic changes in myopia through a nontoxic mechanism［J］.Exp Eye Res，2002，74(1):103－111.

［3］ Tigges M，Iuvone PM，Fernandes A，et al.Effects of muscarinic cholinergic receptor antagonists on postnatal eye growth of rhesus monkeys［J］.Optom Vis Sci，1999，76(6):397－407.

［4］ Diether S，Schaeffel F，Lambrou GN，et al.Effects of intravitreally and intraperitoneally injected atropine on two types of experimental myopia in chicken［J］.Exp Eye Res，2007，84(2):266－274.

［5］ Berntsen DA，Sinnott LT，Mutti DO，et al.A randomized trial using progressive addition lenses to evaluate theories of myopia progression in children with a high lag of accommodation［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(2): 640－649.

［6］ Siegwart JT Jr，Norton TT.Binocular lens treatment in tree shrews:effect of age and comparison of plus lens wear with recovery from minus lens－induced myopia［J］.Exp Eye Res，2010，91(5):660－669.

［7］ Anderson H，Stuebing KK，Fern KD，et al.Ten－year changes in fusional vergence，phoria，and nearpoint of convergence in myopic children［J］.Optom Vis Sci，2011，88(9):1060－1065.

［8］ Zhou X，Ye J，Willcox MD，et al.Changes in protein profiles of guinea pig sclera during development of form deprivation myopia and recovery［J］.Mol Vis，2010，16: 2163－2174.

［9］ Leung KH，Yiu WC，Yap MK，et al.Systematic investigation of the relationship between high myopia and polymorphisms of the MMP2，TIMP2，and TIMP3 genes by a DNA pooling approach［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(6):3893－3900.

［10］ 何耀红，王 辰，庞宝森，等.基质金属蛋白酶及其抑制物在高碳酸血症大鼠肺组织中的表达［J］.中国病理生理杂志，2010，26(1):116－121.

［11］ 戴淑真，曾骏文，高 岩，等.哌仑西平对鸡形觉剥夺性近视的作用［J］.眼科研究，2004，22(2):144－147.

［12］ 邓长柏，朱 萍.TGF－β1对肌成纤维细胞MMP－2激活的影响［J］.中国病理生理杂志，2009，25(7): 1430－1431，1434.