Egr－1介导了IL－1β诱导的小鼠软骨细胞凋亡*

叶志强， 张荣凯， 陈郁鲜， 戴海涛， 冯 辉， 杜庚衡， 曾 花， 曾 春△

(中山大学附属第三医院1急诊科，2骨科，广东广州510630;3中山大学附属第五医院骨科，广东珠海519000)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种在老年人群中最常见的退行性关节疾病，骨关节炎的病理改变通常涉及整个关节，包括滑膜、软骨及软骨下骨，最终导致关节软骨破坏和软骨下骨赘形成，整个关节发生重塑。软骨细胞是关节软骨中唯一存在的一种细胞，研究表明关节软骨内的软骨细胞发生凋亡，是骨关节炎发生过程中软骨退化的关键事件［1］。早在1998年，Hashimoto等［2］用流式细胞术检测到骨关节炎患者膝关节中软骨细胞有22.3%发生凋亡，而正常人膝关节软骨细胞的凋亡率仅为4.8%。2000年，Heraud等［3］采用TUNEL和Annexin－V标记的方法检测到髋关节骨关节炎患者中有18%～21%软骨细胞发生凋亡，而正常对照关节软骨中只检测到2%～5%软骨细胞发生凋亡。以上结果表明骨关节炎患者关节软骨细胞凋亡是广泛存在的。因此，阐明骨关节炎发生过程中软骨细胞凋亡发生的机制，发现介导软骨细胞凋亡的关键蛋白，对于确立骨关节炎的新防治靶点有重要意义。本研究采用白细胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)诱导软骨细胞凋亡的骨关节炎细胞模型，阐述了转录因子早期生长反应蛋白1(early growth response protein 1，Egr－1)在软骨细胞凋亡中的作用。

材料和方法

1 材料

DMEM培养基、胎牛血清、Lipofectamine RNAi MAX、Hoechst 33258等购自Invitrogen;细胞6孔培养板、24孔培养板购自 Corning;Egr－1抗体 CST 4153、caspase－3抗体CST9664、3－磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体CST2118均购自Cell Signaling Technology;ECL试剂盒购自广州永诺生物科技有限公司;胶原酶D购自Sigma;体外重组小鼠IL－1β纯蛋白购自R＆D公司;定量RT－PCR(quantitative RT－PCR，qRT－PCR)引物购自上海英骏生物技术有限公司，具体序列为:Egr－1正向5'－TATGAGCACCTGACCACAGAG－3'，反向5'－GCTGGGATAACTCGTCTCCA－3';GAPDH正向 5'－TTGTCATGGGAGTGAACGAGA－3'，反向5'－CAGGCAGTTGGTGGTACAGG－3'。Egr－1 siRNA片段序列为:si－Egr－1: 5'－GGACAAGAAAGCAGACAAA－3'，si－Egr－2:5'－GATGAACGCAAGAGGCATA－3'，对照序列为:5'－AAUCGCAUAGCGUAUGCCG－3'，均购自上海吉玛制药技术有限公司。

2 方法

2.1 小鼠关节软骨细胞的体外培养 将新生小鼠麻醉后处死，手术分离股骨颈、股骨髁和胫骨平台，3 g/L胶原酶D 37℃消化45 min，回收软骨片后置于0.5 g/L胶原酶D溶液中，37℃消化过夜。回收分离的细胞悬液，用完全DMEM培养基将细胞密度稀释至4×107/L，种植在6孔板中，培养6～7 d后，细胞逐渐融合。

2.2 流式细胞术检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达用胰酶将贴壁培养的原代软骨细胞消化成单细胞悬液，2%甲醛固定，90%冰乙醇打孔，Ⅱ型胶原抗体室温染色1 h，Alexa 488Ⅱ抗室温染色30 min，PBS清洗后用流式细胞仪检测Ⅱ型胶原的表达情况。

2.3 Western blotting 将软骨细胞种植在6孔培养板，至细胞融合度约80%，用IL－1β处理细胞，100 μL裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液至1.5 mL EP管，超声3次打断基因组DNA，采用Bradford方法进行蛋白定量，煮沸样本5 min，冰上冷却后10 000×g离心30 s，取上清进行SDS－PAGE，然后100 V转膜1 h，0.5%(W/V)脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h，4℃Ⅰ抗孵育过夜，0.1%(V/V)TBST洗膜2次后，室温孵育Ⅱ抗1 h，洗膜3次后即用ECL显色曝光。

2.4 qRT－PCR 采用Trizol提取软骨细胞RNA，Q－PCR反应使用SsoFast EvaGreen Supermix在Bio－Rad IQ5上完成，每个反应重复3次。PCR反应条件:95℃初始变性，5 min后扩增40个循环:95℃30 s，95℃1 min，72℃ 1 min。扩增完成后，观察溶解曲线以判断信号的特异性。以GAPDH扩增信号作为内参照。mRNA相对表达量使用公式2－ΔCt计算(ΔCt=ΔCtEgr－1－CtGAPDH)。

2.5 RNA干扰 将软骨细胞种植在6孔板中，至细胞融合度约60%时准备进行转染，每个孔siRNA片段的量为200 pmol，按照Lipofectamine RNAiMAX的说明书进行操作。转染24 h后用IL－1β纯蛋白处理细胞。

3 统计学处理

结果

1 原代软骨细胞纯度的鉴定

正常软骨细胞组成性表达Ⅱ型胶原，为了检测原代软骨细胞的纯度，我们将体外分离培养的软骨细胞固定破膜后，用Ⅱ型胶原特异性标记软骨细胞，采用流式细胞仪检测软骨细胞的纯度，结果表明，软骨细胞的纯度较高，可以用于凋亡研究，见图1。

Figure 1.The purity of chondrocyte determined by flow cytometry.图1 流式细胞术检测软骨细胞的纯度

2 IL－1β诱导软骨细胞凋亡

如图2A所示，细胞发生凋亡后呈现典型的核固缩形态，对凋亡的细胞进行了计数和统计(图2B)后发现，和对照组相比，IL－1β处理软骨细胞4 h后凋亡率有轻微增加，但两组之间无显著差异，8 h和12 h后凋亡的发生率分别约为22%和43%，统计分析显示与对照组之间的差异有统计学意义，IL－1β呈时间依赖性地诱导软骨细胞凋亡。激活型caspase－3是细胞凋亡的公认指标，因此我们还用 Western blotting检测了caspase－3的表达变化，随着IL－1β处理时间增加，激活型caspase－3发生时间依赖的表达上调，见图2C。结果表明，IL－1β能诱导软骨细胞发生典型的凋亡。

Figure 2.IL－1β induced apoptosis of chondrocytes.A:Hoechst 33258 staining of apoptotic chondrocytes(×200).B:quantitation of the results in A.At least 700 cells were counted in each group.C:IL－1β up－regulated the expression of cleaved caspase－3.±s.n=3.*P＜0.05 vs control.图2 IL－1β诱导软骨细胞凋亡

3 IL－1β诱导软骨细胞凋亡中Egr－1表达上调

图3A显示伴随着细胞凋亡的发生，Egr－1 mRNA在2 h有轻微上调，4 h及8 h发生显著上调。图3B显示Egr－1蛋白在4 h及8 h有显著上调，早于软骨细胞发生显著凋亡的时间(8 h)。以上结果表明，IL－1β在诱导软骨细胞凋亡的同时，也诱导了转录因子Egr－1 mRNA及蛋白的表达上调。

4 siRNA干扰IL－1β诱导的Egr－1表达上调

2个Egr－1 siRNA片段均有效抑制了IL－1β诱导的Egr－1 mRNA及蛋白质表达上调，见图4。

5 干扰Egr－1表达保护IL－1β诱导的软骨细胞凋亡

图5A、B显示IL－1β处理软骨细胞12 h后引起约40%细胞发生凋亡，而采用2个RNA片段有效干扰Egr－1的表达后细胞的凋亡率显著降低，分别约为15%和12%，同时细胞凋亡的标志物激活型caspase－3的表达量也受到抑制，见图5C。以上结果表明干扰Egr－1的表达对软骨细胞有一定的保护作用，Egr－1参与了IL－1β诱导的体外培养软骨细胞凋亡。

Figure 3.IL－1β induced the transcription－dependent up－regulation of Egr－1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control.图3 IL－1β诱导转录依赖性Egr－1上调

Figure 4.Effective knockdown of Egr－1 expression by siRNA.±s.n=3.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs scrambled.图4 siRNA抑制Egr－1表达

讨论

骨关节炎的发病率高，是目前世界上最常见的关节炎。骨关节炎的发病率与年龄密切相关，随着年龄的增长，骨关节炎的发病率显著上升［4］。世界卫生组织的统计结果表明:55岁以上人群中骨关节炎的患病率约为80%，而60岁以上的人群几乎都患有不同程度的骨关节疾病。我国是一个人口大国，而且即将迈入老年化社会，因此，骨关节炎是不可回避的一个社会问题。由于目前的研究成果对骨关节炎的发病机制缺乏从根本上的认识，因此在骨关节炎的治疗手段上依然相当保守，在疾病发展的晚期，患者最终必须接受全关节置换。因此，从分子水平上阐明骨关节炎的发病机制，寻找骨关节炎治疗的关键靶点，成为亟待解决的关键问题。

IL－1β是与骨关节炎发病密切相关的炎症因子，通过IL－1β刺激软骨细胞是广泛被认可和应用的一种骨关节炎细胞模型［5－6］，然而IL－1β诱导软骨细胞凋亡的机制，目前尚不清楚。Egr－1是即刻早期基因家族中的一员，这个家族在受到外界刺激后能迅速被激活，而不依赖于任何新蛋白的合成，Egr－1的表达产物是一个转录因子，通过调控下游基因的表达从而引起细胞功能的改变，目前的研究发现至少有30多种基因的转录需要Egr－1参与，涉及细胞生长分化和凋亡、免疫刺激、炎性细胞趋化等多个方面［7］。Egr－1与细胞凋亡的发生密切相关［8］，目前的研究认为Egr－1主要通过3种方式发挥促细胞凋亡作用:(1)直接转录上调抑癌基因p53的表达［9］;(2)与促凋亡基因c－Jun直接相互作用并增强其促凋亡活性［10］;(3)直接转录激活PTEN［11］。

Figure 5.Knockdown of Egr－1 protected chondrocytes from apoptosis induced by IL－1β.A:Hoechst 33258 staining of apoptotic chondrocyte(×200).B:quantitation of the results in A.At least 700 cells were counted in each group;C:up－regulation of cleaved caspase－3 was inhibited after knockdown of Egr－1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs scrambled.图5 干扰Egr－1表达保护IL－1β诱导的软骨细胞凋亡

在本研究中我们发现伴随着软骨细胞凋亡的发生，IL－1β能时间依赖性上调Egr－1的表达水平，而有效干扰Egr－1的表达后，软骨细胞对IL－1β的促凋亡作用有抵抗，细胞凋亡率从40%下降到15%左右，表明Egr－1在软骨细胞凋亡过程中发挥关键作用，可能是介导骨关节炎发生过程中的关键蛋白。但Egr－1促软骨细胞凋亡的靶基因尚未明确，进一步阐明Egr－1通过何种机制发挥促软骨细胞凋亡作用是我们下一步研究的重点。

［1］ Goggs R，Carter SD，Schulze－Tanzil G，et al.Apoptosis and the loss of chondrocyte survival signals contribute to articular cartilage degradation in osteoarthritis［J］.Vet J，2003，166(2):140－158.

［2］ Hashimoto S，Ochs RL，Komiya S，et al.Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in human osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，1998，41(9):1632－1638.

［3］ Heraud F，Heraud A，Harmand MF.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage［J］.Ann Rheum Dis，2000，59(12):959－965.

［4］ Shane Anderson A，Loeser RF.Why is osteoarthritis an age－related disease?［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol，2010，24(1):15－26.

［5］ Mengshol JA，Vincenti MP，Brinckerhoff CE.IL－1 induces collagenase－3(MMP－13)promoter activity in stably transfected chondrocytic cells:requirement for Runx－2 and activation by p38 MAPK and JNK pathways［J］.Nucleic Acids Res，2001，29(21):4361－4372.

［6］ Shakibaei M，John T，Seifarth C，et al.Resveratrol inhibits IL－1β－induced stimulation of caspase－3 and cleavage of PARP in human articular chondrocytes in vitro［J］.Ann N Y Acad Sci，2007，1095:554－563.

［7］ 初 令，曾庆富.转录因子Egr－1及其在肺病变中的研究进展［J］.中国病理生理杂志，2004，20(2):268－272.

［8］ 秦 丽，张惠华，郭淑军，等.外源性EGR1瞬时表达对骨肉瘤细胞细胞周期和凋亡的影响［J］.中国病理生理杂志，2011，27(2):293－299.

［9］ Nair P，Muthukkumar S，Sells SF，et al.Early growth response－1－dependent apoptosis is mediated by p53［J］.J Biol Chem，1997，272(32):20131－20138.

［10］ Levkovitz Y，Baraban JM.A dominant negative Egr inhibitor blocks nerve growth factor－induced neurite outgrowth by suppressing c－Jun activation:role of an Egr/c－Jun complex［J］.J Neurosci，2002，22(10):3845－3854.

［11］ Virolle T，Adamson ED，Baron V，et al.The Egr－1 transcription factor directly activates PTEN during irradiation－induced signalling［J］.Nat Cell Biol，2001，3 (12):1124－1128.