SDF－1/CXCR4轴通过调控间充质干细胞定向分化修复缺氧缺血性脑损伤*

余 勤， 林 洁， 刘丽珍， 王 艳， 宣晓波， 王 标， 单 威， 周丽萍， 刘 伟

(浙江中医药大学1生物工程学院，3第一临床医学院，浙江杭州310053; 2浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

缺氧缺血性脑损伤(hypoxia－ischemia brain damage，HIBD)是严重威胁现代人健康的一大类疾病，死亡率和致残率高。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是修复缺氧缺血性脑损伤颇具前景的治疗方法。MSCs可在特定条件下诱导分化为神经元样细胞和神经胶质细胞［1］。我们前期研究结果中也显示，大鼠间充质干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤大鼠脑内可存活、迁移，并可明显改善大鼠的学习、记忆能力［2］。但是目前对外源性间充质干细胞移植治疗脑损伤的确切机制尚不明确，治疗效率问题有待解决。

对于MSCs移植后修复脑损伤的研究，目前认为与基质细胞衍生因子－1(stromal cell－derived factor－1，SDF－1)/CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)轴有关。SDF－1和CXCR4广泛地表达于多种组织和细胞中，体内SDF－1和CXCR4基因敲除将导致小鼠小脑、胃肠道和造血系统发育异常而至胚胎早期死亡［3］。在MSCs诱导向成骨细胞分化过程中，阻断SDF－1/CXCR4信号可抑制骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)诱导的成骨分化［3］。由此我们推测，SDF－1/CXCR4不仅参与干细胞的迁移，其在干细胞分化、组织器官发生及再生中也可能发挥着重要作用。

本研究旨在探讨SDF－1/CXCR4轴在MSCs定向分化中的作用，明确MSCs体内输注后修复脑损伤的确切机制，以提高MSCs治疗的靶向性和高效性。

材料和方法

1 动物

大鼠间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells，rMSCs)培养的骨髓供体为健康SD大鼠，体重(100 ±10)g，雄性，清洁级;用于HIBD模型的动物为健康幼年SD大鼠(4周龄左右)，体重(80±10)g，雄性，清洁级;均购于浙江中医药大学实验动物中心。

2 主要试剂与仪器

DMEM/F12 1∶1培养基(Invitrogen)，胎牛血清(FBS，Gibco)，1%O2、5%CO2和94%N2混合气及8%O2和92%N2混合气(杭州特种气公司)，β－巯基乙醇(Sigma)，小鼠抗神经元特异性烯醇化酶(neuron－specific enolase，NSE;Enzo Life Sciences)，兔抗SDF－1α(BioVision)，兔抗CXCR4(BioVision)，兔抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP;博士德产品)，鼠源SDF－1α(Peprotech)，Mozobil(AMD3100，Sigma)，细胞计数试剂盒－8(Cell Counting Kit－8，凯基生物产品)。FACSCalibur型流式细胞仪(BD)，Transwell小室(Greiner Bio－One)，低氧培养盒(长沙长锦科技有限公司)。

3 主要方法

3.1 rMSCs的体外培养及低氧培养 取健康SD青年雄性大鼠，脱颈椎处死，无菌条件下取出股骨和胫骨，清除附着的肌肉组织，暴露骨骺端，用5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12 1∶1培养基冲出骨髓，离心后制成单细胞悬液，接种于一次性塑料培养瓶中，置CO2细胞培养箱中培养。低氧培养时，将70%～80%融合的细胞置于密封的低氧培养盒中，用低氧混合气(1%O2、5%CO2和94%N2)平衡10 min (1 L/min)，然后转移到37℃、5%CO2孵箱中培养。3.2 AMD3100和SDF－1α对rMSCs生长抑制的影响检测 取对数生长期的rMSCs，经0.25%胰酶－1mmol/L EDTA消化，计数，用含10 μg/L、100 μg/L SDF－1α和5 mg/L AMD3100的DMEM/F－12培养液分别制备细胞悬液，96孔培养板中每孔接种200 μL浓度为2.5×107/L的细胞悬液，加入20 μL Cell Counting Kit－8中的溶液，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养2 h。570 nm和630 nm双波长检测各组吸光度(A570和A630);终吸光度(A)=A570－A630。计算细胞生长抑制率(cell growth inhibitory rate，IR)，IR (%)=A对照组－A处理组/A对照组×100%。

3.3 HIBD动物模型的建立 4周龄雄性SD大鼠麻醉后，颈部备皮、消毒，剪开颈正中皮肤2～3 cm，分离皮下脂肪，于胸锁乳突肌深部分离左颈总动脉，用5/0丝线结扎血管两端(相互间隔一定距离)，缝合切口。术后将麻醉未醒的大鼠放回原笼中休息2～3 h，苏醒后置于通以8%O2和92%N2混合气体的密闭容器中，以1.5～2 L/min的流量持续通气2.5 h制成HIBD动物模型。

3.4 RT－PCR检测 细胞样本用Trizol提取法抽提总RNA，海马组织样本则在生物安全柜内根据大鼠脑部结构将海马部剥离，液氮冻存海马组织约25 mg，用时在液氮下用研钵、研杵(泡酸后清洗干净，180℃烘烤2 h以上以去除RNA酶，备用)捣碎研磨，待液氮挥发后，加1 mL Trizol试剂，充分研磨直至试剂由结冰状态变为澄清液体，液体澄清后立即移至1.5 mL离心管中，进行RNA定量，每个样品各取RNA 1.0 μg，进行逆转录(根据TaKaRa公司PrimeScriptTMRT－PCR Kit试剂盒说明书进行操作)，反应条件为37℃20 min，85℃5 s;PCR聚合酶链式反应根据Promega公司PCR Master Mix试剂盒说明书进行操作，反应条件为95℃ 2 min，58℃ 30 s，72℃ 5 min，30个循环。SDF－1α上游引物 5’－TCTTTGGCCTCCTGTAGAATGG－3’，下游引物5’－TCACGGCAAGATTCTGGCTTA－3’，产物240 bp; CXCR4上游引物 5’－AGCAGGTAGCAGTGACCCTCTGA－3’，下游引物5’－GAAGCAGGGTTCCTTGTTGGAGT－3’，产物149 bp;β－actin上游引物5’－GAACCCTAAGGCCAACC－3’，下游引物5’－TGTCACGCACGATTTCC－3’，产物371 bp。

3.5 Western blotting检测 细胞样本于冰上融化，加入细胞裂解液振荡均匀，海马组织制备操作步骤同RT－PCR检测准备步骤，组织冰上研磨后加裂解液，4℃、14 000×g，离心20 min，取上清，BCA法蛋白定量。取100 μg蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS－PAGE)电泳，再用电转移到PVDF膜上; 5%脱脂奶封闭2 h后，加入Ⅰ抗(CXCR4 1∶1 000、SDF－1α 1∶200、NSE 1∶100和GFAP 1∶100)，4℃孵育过夜;TBST液洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温孵育1 h;TBST液洗涤3次;在暗室将ECL发光剂加在膜上，X线胶片曝光，常规方法定影。

3.6 流式细胞术检测rMSCs CXCR4的表达 细胞样本用0.25%胰酶+1 mmol/L EDTA消化，细胞计数，使每例样本的细胞数为1×106个;细胞重悬于5 mL PBS中洗涤，1 500 r/min离心8 min;弃去上清，加100 μL PBS重悬，与CXCR4Ⅰ抗孵育液(Ⅰ抗稀释度为1∶1 000)常温下孵育30 min;PBS洗涤2次(1 500 r/min离心8 min)，加100 μL PBS重悬，与PE－Ⅱ抗(稀释度为1∶1 000)4℃避光孵育30 min; PBS洗涤2次后(1 500 r/min离心8 min)，弃去PBS，再加入400 μL 1%多聚甲醛重悬细胞，用流式细胞仪分析。

3.7 rMSCs诱导向神经细胞分化 当rMSCs爬片接近70% 融合状态时，用含1 mmol/L β－巯基乙醇的DMEM/F12(20%FBS)预诱导24 h，更换培养液，PBS洗涤3次，再加入含5 mmol/L β－巯基乙醇的无血清DMEM/F12诱导3～6 h，光镜下观察细胞形态变化。

3.8 免疫细胞化学鉴定细胞分化 分化后的细胞爬片用4%多聚甲醛固定15 min，Ⅰ抗(NSE 1∶500，GFAP 1∶100)4℃孵育过夜，PBS(含0.05%Tween 20)冲洗，Ⅱ抗湿盒中孵育30 min，PBS冲洗，5 min× 3次，DAB显色，蒸馏水冲洗以终止反应。随机计数相应时点20个视野中阳性细胞，计算平均值。

4 统计学处理

结果

1 AMD3100和SDF－1α对rMSCs生长抑制的影响

5 mg/L AMD3100、10 μg/L和100 μg/L SDF－1α作用于rMSCs的IR均小于5%，见表1，表明它们对rMSCs的生长均无显著抑制作用。

表1 各处理组的细胞生长抑制率Table 1 .The inhibitory rates(IR)of cell growth in different groups(%.±s.n=3)

表1 各处理组的细胞生长抑制率Table 1 .The inhibitory rates(IR)of cell growth in different groups(%.±s.n=3)

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2 低氧对rMSCs中CXCR4表达的影响

rMSCs低氧6 h与12 h CXCR4 mRNA表达水平均较0 h组明显增加(P＜0.01)，在24 h显著减小(P＜0.05)，48 h和72 h时CXCR4 mRNA的转录水平降低，见图1A;rMSCs低氧各时点CXCR4蛋白表达水平均较0 h组增加，其中低氧6 h CXCR4蛋白表达增加最为显著(P＜0.01)，12 h和24 h组与0 h组比较CXCR4蛋白表达增加有显著差异(P＜0.05)，见图1B;rMSCs低氧培养6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，流式细胞术检测结果显示，低氧培养各时点rMSCs表面受体CXCR4表达均较对照组增加(P＜0.05)，见图1C。

Figure 1.Hypoxia elevated the CXCR4 expression in rMSCs.A:mRNA expression detected by RT－PCR;B:protein expression detected by Western blotting;C:protein expression detected by flow cytometry.±s.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control (0 h).图1 缺氧促进rMSCs CXCR4的表达

3 SDF－1α及AMD3100对rMSCs中CXCR4表达的影响

10 μg/L SDF－1α处理rMSCs 2 d和5 mg/L AMD3100处理rMSCs 3 d后，RT－PCR、Western blotting及流式细胞术检测CXCR4表达水平的结果显示，SDF－1α处理后CXCR4 mRNA表达明显增加(P＜0.05)，AMD3100处理后CXCR4 mRNA表达较对照组显著下降(P＜0.05)，见图2A;Western blotting及流式细胞术检测结果与CXCR4 mRNA表达的趋势一致，见图2B、2C。

4 海马组织中SDF－1α的表达

大鼠造模后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d，各实验组海马组织SDF－1α mRNA和蛋白表达均较正常组有明显增加，7 d时增加最为显著(P＜0.01)，之后表达回落，持续到21 d仍有稳定表达，见图3。

Figure 2.SDF－1α augmented the expression of CXCR4 in rMSCs.A:mRNA expression detected by RT－PCR;B:protein expression detected by Western blotting;C:protein expression detected by flow cytometry.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.图2 SDF－1α促进rMSCs CXCR4的表达

Figure 3.SDF－1α mRNA(A)and protein(B)expression changed in hippocampus tissues of HIBD rats.±s.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control(0 d)group.图3 缺血缺氧大鼠海马组织SDF－1α表达的变化

5 免疫细胞化学鉴定细胞分化

正常rMSCs、AMD3100拮抗后的rMSCs经诱导向神经细胞分化，再用免疫细胞化学鉴定细胞分化，结果显示，AMD3100拮抗后的分化细胞 NSE和GFAP阳性表达的细胞数明显较正常分化的细胞少，见图4。随机计数相应时点20个视野中阳性细胞，计算平均值，见表2。

Figure 4.The expression of neural－specific markers in different groups(immunocytochemical staining，×200).图4 不同处理组神经特异性标志物的表达

表2 rMSCs神经分化中NSE和GFAP阳性细胞数比较Table 2 .Comparison of NSE and GFAP positive cell numbers of rMSCs in neural differentiation(±s.n=3)

表2 rMSCs神经分化中NSE和GFAP阳性细胞数比较Table 2 .Comparison of NSE and GFAP positive cell numbers of rMSCs in neural differentiation(±s.n=3)

*P＜0.05 vs AMD3100(－).

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讨论

脑缺氧缺血是造成神经功能缺损的常见原因，其诱导的脑损伤是一种弥漫性、进行性的神经元坏死和神经元程序性死亡。脑缺氧缺血损伤治疗的关键在于挽救缺血半暗带区濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复。目前治疗主要是应用多种脑细胞活性药物抑制脑细胞凋亡，但对已坏死的脑细胞则无作用。因此通过细胞移植使得损伤的脑组织及脑神经得到重建，改善脑功能，已成为该病治疗一个新的研究热点。间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞［5］，在一定条件下能够分化为多种中胚层和神经外胚层发育来源的细胞［6］。Kopen等［7］将MSCs注入新生小鼠的侧脑室，发现MSCs迁移遍及整个前脑和小脑，在纹状体和海马中MSCs表达GFAP，提示其已经分化为星形胶质细胞;在嗅觉小岛、嗅球、小脑的内颗粒层发现大量的MSCs，其不但表达巢蛋白(nestein)，还表达神经元的特异性表面标记NSE、神经元特异性核蛋白和神经元中丝蛋白，提示已经分化为神经元。另有研究显示rMSCs移植可改善缺氧缺血性脑损伤大鼠脑部功能损伤［2］。由此，利用MSCs替代原来受损或功能缺陷的神经组织治疗神经系统疾病是一种颇具前景的治疗方法［8－9］。但是，在外源性MSCs移植治疗中，由于修复的确切机制尚未明确，使得治疗效率问题尚未真正得到解决。本课题旨在研究移植MSCs向神经细胞分化的确切机理，以提高MSCs治疗的靶向性和高效性。

SDF－1是为数不多的表达于脑组织中的趋化因子之一，在正常神经系统中SDF－1量维持在较低水平，不发挥迁移趋化作用，主要由星形胶质细胞和神经元表达［10］。当中枢神经系统发生炎症、缺血和低氧等病变后，可引起SDF－1水平的上调，趋化血液系统中的单核/巨噬细胞向损伤区迁移并发挥相应生物学效应。本研究对HIBD大鼠海马组织中的SDF－1α的表达变化进行了检测，结果显示SDF－1α mRNA及蛋白的表达均随低氧时间逐渐增加，7 d时达到顶峰持续到21 d仍有稳定表达，且较对照组表达明显，提示HIBD大鼠脑中的SDF－1表达增加。

由于体外扩增的MSCs表面CXCR4的表达率要显著低于骨髓中MSCs表达的CXCR4［11］。我们的实验中用10 μg/L SDF－1α与rMSCs共孵育2 d，RT－PCR及Western免疫印迹结果显示，SDF－1α处理组中CXCR4 mRNA及蛋白的表达均显著增加，流式细胞术检测也显示rMSCs表面受体CXCR4表达率上升明显。细胞表面CXCR4表达增加验证了微小剂量的SDF－1α可诱导胞内CXCR4向细胞表面转移的假设，使SDF－1/CXCR4轴介导的细胞生物学效应增强。

由于体内环境的氧浓度明显低于体外，外源输入的MSCs处于低氧状态，实验研究表面持续性低氧对MSCs增殖没有抑制作用且具有促进作用［12－13］。同时本实验同时发现，rMSCs缺氧6 h与12 h CXCR4 mRNA转录水平均较常氧组明显增加(P＜ 0.01)，24 h显著减小。rMSCs低氧各时点CXCR4蛋白表达水平均较常氧组增加，其中低氧6 h CXCR4蛋白表达上调最为显著，其它组与常氧组有显著差异。另外，流式细胞术检测进一步证实了rMSCs低氧培养时CXCR4表达增加这一结论，提示低氧环境不仅有助于细胞生长，且能提高SDF－1α的特异性受体CXCR4的表达。

以上结果提示在MSCs修复缺氧缺血性脑损伤中，低氧能形成适合干细胞生长的环境且使MSCs表面的CXCR4表达增加，同时促进脑内微环境中SDF－1表达增加，进而加强了SDF－1/CXCR4轴的生物学关联。

而SDF－1/CXCR4轴在干细胞分化、组织器官发生及再生中也有重要作用。在MSCs诱导向成骨细胞分化过程中，SDF－1通过细胞内蛋白Smad和MAPK信号通路促进BMP2表达并诱导MSCs向成骨分化［4］。在神经发育的过程中，SDF－1是参与神经发育的重要蛋白，SDF－1/CXCR4信号通路在神经细胞生长、增殖、迁移、轴突形成等过程中均有重要作用。由此我们假设SDF－1/CXCR4轴可能在调控MSCs分裂增殖、启动向神经细胞分化以及轴突的形成过程有关，但是目前对SDF－1/CXCR4轴对MSCs增殖和分化的影响及其机制尚不明确。本实验用 SDF－1α特异性受体 CXCR4的拮抗剂AMD3100处理MSCs后进行体外神经分化诱导，比较其与正常rMSCs神经分化率的变化。实验结果表明，在免疫细胞化学鉴定中，AMD3100拮抗后的rMSCs分化后NSE和GFAP阳性表达的细胞数较正常rMSCs明显较少。

综上所述，MSCs修复缺氧缺血性脑损伤中，脑部的低氧状态能为MSCs提供适合存活的环境，并且使MSCs表面的CXCR4表达增加，同时缺血缺氧环境能促进脑内微环境中SDF－1表达的增加，进而加强SDF－1/CXCR4轴的生物学效应，而MSCs在表面受体CXCR4被拮抗的情况下向神经分化的能力下降，表明SDF－1/CXCR4轴具有调控rMSCs神经分化的作用，在rMSCs移植治疗缺氧缺血性脑损伤中具有重要意义。

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