TGF－β1作用后老龄大鼠心肌成纤维细胞p38 MAPK通路和JNK通路的变化

林运灵， 李维维， 陈良龙

(福建医科大学附属协和医院心内科，福建福州350001)

老龄是心肌梗死后不良事件发生的独立预测因素［1－2］。在成功接受经皮冠状动脉介入治疗后，70岁以上心肌梗死患者发生心室重塑、心力衰竭的比例较70岁以下人群增高［3］。老龄使得心肌损伤后修复机制受损，从而导致加剧心梗后心室重塑、心功能恶化，但其具体机制仍未明确。与成年大鼠相比，老龄大鼠心梗后肉芽组织生长缓慢，瘢痕组织中胶原含量明显下降［4］。在心梗面积可比的情况下，与青年小鼠相比，老龄小鼠心肌梗死区域中肌成纤维细胞密度显著降低，胶原含量减少，导致瘢痕组织强度减弱，梗死区域扩展，心功能受损更为严重［4］。在老龄动物中，损伤修复过程中成纤维细胞向肌成纤维细胞分化发生障碍，但其具体机制仍未阐明。转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)通过Smad及非Smad信号通路参与器官损伤后的修复过程。TGF－β1在心肌梗死后大量表达，是激活成纤维细胞最关键的分子［5］;研究显示，老龄小鼠心肌成纤维细胞TGF－β1/Smad信号通路受损;但老龄对心肌成纤维细胞TGF－β1的非Smad信号通路是否有影响，目前尚不清楚。本研究观察老龄大鼠成纤维细胞对TGF－β1作用后p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)和c－Jun氨基端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)磷酸化水平的变化，探讨老龄对大鼠心肌成纤维细胞TGF－β1的非Smad信号通路的影响。

材料和方法

1 动物与主要试剂

健康雄性Sprague－Dawley(SD)乳鼠(3 d)及老龄(24月龄)大鼠，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限公司。DMEM培养基、胶原蛋白酶和MTT购自Sigma。胎牛血清购自HyClone。抗波形蛋白抗体、α－平滑肌肌动蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)购自Abcam。Phospho－p38、phospho－JNK购自CST。

2 方法

2.1 大鼠心脏成纤维细胞培养 SD大鼠断颈处死后，常规消毒胸腹部皮肤，暴露出心脏，沿心脏根部剪下心脏，放入含肝素的PBS中洗净血液，去除心房和残留的主动脉。将心脏移至消化管中，剪碎，加入II型胶原酶消化液10 mL，37℃水浴中消化20 min，自然沉淀后弃去上清。再加入上述酶消化液10 mL，在37℃水浴中消化后，小心吸取上清，用含5%FBS的DMEM中和胶原酶，200×g离心7 min，沉淀用DMEM悬浮后4℃保存。重复上述消化过程直至组织块完全被消化。DMEM悬浮的细胞经200×g离心7 min后以含15% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM悬浮，经细胞筛过滤后，放入CO2培养箱中静置2 h使心脏成纤维细胞贴壁。生长近融合时以1∶3传代，实验采用第3代细胞，经无血清培养24 h后进行干预［6］。

2.2 实验分组及干预 实验分为4组，分别为乳鼠PBS对照组(N1组)，加入等体积的PBS;乳鼠TGF－β1干预组(N2组)，加入TGF－β1(5 μg/L);老龄鼠PBS对照组(A1组)，加入等体积的PBS;老龄鼠TGF－β1干预组(A2组)，加入TGF－β1(5 μg/L)。

2.3 免疫细胞化学 心肌成纤维细胞终止培养，漂洗后4%多聚甲醛固定，室温下30 min，PBS冲洗3次，每次5 min;滴加0.3%Triton－X 100，室温下8 min，PBS冲洗3次，每次5 min;滴加3%H2O2溶液，室温下10 min，以灭活内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，每次5 min;滴加Ⅰ抗抗波形蛋白肌动蛋白、肌动蛋白，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3次，每次5 min;滴加羊抗鼠IgG抗体－HRP多聚体，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min;DAB显色10～15 min，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。每组染色均设有阴性对照，以0.01 mol/L PBS代替Ⅰ抗。2.4 MTT法测定细胞增殖活力 取对数生长期心肌成纤维细胞5×103cells/well的密度接种于96孔板中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h后换无血清DMEM培养基，继续培养24 h后，吸弃各孔培养基，随后分组再培养24 h。各组于药物刺激结束前4 h，吸弃上清，加入MTT 20 μL，37℃、5%CO2培养4 h后，吸弃孔内培养上清液，加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上490 nm处测定吸光度。

2.5 Western blotting检测心肌成纤维细胞p38和JNK蛋白磷酸化水平 每孔中均加入200 μL裂解缓冲液(50 mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1%NP－40，0.5%sodium deoxycholate，0.1% SDS，100 mg/L PMSF，2 mg/L aprotinin)，置于冰上充分裂解，用刮棒将细胞刮下，然后将细胞碎片和裂解液移至0.6 mL离心管中。加入等体积的2×SDS (临用前加入5×DTT液)，超声振荡5 min，立即放入水浴锅中100℃煮10 min，4℃12 000 r/min离心10 min，取上清分装，－20℃保存备用。上清液中蛋白浓度以BCA法测定。取等量蛋白(50 μg/well)，经SDS－PAGE分离，电转移至硝酸纤维素滤膜上，脱脂奶粉封闭，加入1∶500稀释的Ⅰ抗，4℃过夜，用辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗检测目标蛋白。ECL化学发光试剂显色，X线胶片压片、显影、定影，图像分析系统测定目的条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH条带的吸光面积积分比值来评定其蛋白表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 11.5统计软件分析处理，数据以均数±标准差(±s)表示。两组结果比较采用t检验，多组结果比较采用单因素方差分析及Turkey检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 心肌成纤维细胞的培养观察及鉴定

在倒置显微镜下观察，心肌成纤维细胞呈梭形、多角形，细胞质透明，细胞核明显大，呈椭圆形，常含有2～3个核(图1A)。细胞抗波形蛋白染色阳性，平滑肌肌动蛋白阴性，符合心肌成纤维细胞染色特征(图1B、C)。

Figure 1.Morphological observation and identification of cardiac fibroblasts(×200).A:morphology of cardiac fibroblasts under phase－contrast microscope;B:immunocytochemical staining for vimentin in cardiac fibroblasts;C:immunocytochemical staining for actin in cardiac fibroblasts.图1 心肌成纤维细胞形态学观察及鉴定

2 各组细胞增殖对比

在无TGF－β1刺激时，N1组与A1组平均吸光度无显著差异(0.36±0.04 vs 0.32±0.03，n=6，P＞0.05);在加入TGF－β1后，A2组平均吸光度较N2组显著减低(0.54±0.06 vs 0.44±0.05，n=6，P＜0.05)，提示在TGF－β1作用下，老龄组心肌成纤维细胞增殖能力下降。

3 各组总p38及磷酸化p38的表达水平

Western blotting显示，各组总p38蛋白表达水平没有显著差异;加入TGF－β1后，N2组的磷酸化p38较N1组明显升高(0.80±0.12 vs 0.18±0.03，n= 6，P＜0.05);A2组的磷酸化p38较A1组明显升高(0.42±0.14 vs 0.16±0.05，n=6，P＜0.05);与N2组相比，A2组磷酸化 p38表达水平显著下降(P＜0.05)，见图2。

4 各组总JNK及磷酸化JNK的表达水平

Western blotting显示，各组总JNK蛋白表达水平没有显著差异;加入TGF－β1后，N2组的磷酸化JNK较N1组明显升高(0.93±0.21 vs 0.06±0.02，n=6，P＜0.05);A2组的磷酸化JNK较A1组明显升高(0.54±0.16 vs 0.05±0.01，n=6，P＜0.05);与N2组相比，A2组磷酸化JNK表达水平显著下降(P＜0.05)，见图3。

讨论

Figure 2.Expression of total p38 and phospho－p38 in cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.N1:neonatal cardiac fibroblasts;N2:neonatal cardiac fibroblasts treated with TGF－β1;A1:aged cardiac fibroblasts;A2: aged cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.图2 各组总p38及磷酸化p38的表达水平

Figure 3.Expression of total JNK and phospho－JNK in cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.N1:neonatal cardiac fibroblasts;N2:neonatal cardiac fibroblasts treated with TGF－β1;A1:aged cardiac fibroblasts;A2:aged cardiac fibroblasts treated with TGF－β1.图3 各组总JNK及磷酸化JNK的表达水平

心肌成纤维细胞是心脏中数量最多的间质细胞，占心脏非心肌细胞的90%～95%，也是心脏细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的主要分泌细胞，在维持正常心脏的ECM中具有非常重要的作用，还是病理性心肌纤维化和心室重塑的关键性调节因子［7－8］。成纤维细胞是组织损伤修复的主要效应细胞。研究表明，在正常情况下心肌成纤维细胞处于静止状态，急性心肌梗死后，静止状态的成纤维细胞在机械应力及细胞因子如TGF－β1、血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)、内皮素(endothelin，ET)、白细胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)等病理因素的作用下发生活化，激活后的成纤维细胞(即肌成纤维细胞)迁移到心梗区域，表达α－平滑肌肌动蛋白，分泌炎症因子、趋化因子、生长因子等，启动损伤后心肌修复过程［5，9］。老龄导致组织损伤后愈合能力下降。与青年人相比，老龄患者伤口愈合速度缓慢［10－11］;老龄动物在创伤愈合过程中对外源性生长因子反应低下［12］。TGF－β1是最重要的促纤维化生长因子，可诱导心肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，为诸多因素所致心肌纤维化的共同通路。

TGF－β1信号转导通路包括Smad及非Smad信号通路两类［13－14］。TGF－β1通过 Smad与非 Smad信号通路(包括p38和JNK)，参与心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的活化过程，活化的肌成纤维细胞分泌胶原，参与心肌纤维化过程［15］。MAPK信号通路是TGF－β1非Smad信号通路中最重要的。既往研究显示，老龄导致心肌成纤维细胞增殖能力［16］及迁移能力减弱［17］。与青年大鼠相比，老龄大鼠心梗后TGF－β1的含量并没有显著变化，然而，老龄大鼠成纤维细胞对TGF－β1反应低下，可能与Smad蛋白磷酸化水平减弱导致 TGF－β1/Smad通路受损有关［4］。本研究结果显示，在接受TGF－β1刺激后，老龄大鼠心肌成纤维细胞增殖能力下降;无论是新生大鼠心肌成纤维细胞还是老龄大鼠心肌成纤维细胞的p38及JNK磷酸化水平均明显升高，提示TGF－β1可能同时激活心肌成纤维细胞中的p38及JNK信号通路;本研究同时观察到，老龄组心肌成纤维细胞的p38及JNK磷酸化水平均较幼鼠组下降，提示老龄不仅使TGF－β1/Smad通路受损，同样使得心肌成纤维细胞的TGF－β1/MAPK信号通路相关蛋白功能受损。

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