siRNA沉默转酮醇酶样蛋白1基因对人肝癌HepG2细胞生长微环境的影响

张德太， 左曙荣， 杨 文， 张 科， 宋 斌， 涂启明

(华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，湖北武汉430022)

转酮醇酶样蛋白1(transketolase-like 1 protein，TKTL1)是转酮醇酶基因家族中的重要成员，在肿瘤发生发展上起到十分重要的作用。新近的研究表明，在许多恶性肿瘤中TKTL1无论是在mRNA水平还是蛋白质水平表达均显著上调［1-3］。更有意义的是发现TKTL1表达水平还与肿瘤的临床分期、侵袭转移及预后密切相关，TKTL1高表达预示低分化、预后不良并往往伴有转移［4-5］。如果仅从TKTL1具备转酮醇酶催化功能尚无法解释其表达水平与肿瘤转移的相关性。研究认为，肿瘤细胞生长微环境(包括氧化-还原状态、环境酸性化、缺氧及细胞外基质变化等)是肿瘤发展的决定因素，它决定了肿瘤是发生转移还是消失［6-7］。因此，本文通过siRNA沉默TKTL1基因研究其对肝癌细胞HepG2生长微环境的影响，旨在探讨TKTL1表达与HepG2细胞转移潜能的内在联系。

材料和方法

1 材料

1.1 菌株和细胞 质粒pEGFP-C1-U6(含绿色荧光蛋白基因、耐卡那霉素基因、抗新霉素Rneo基因及人U6启动子)和大肠杆菌DH5α均购自武汉晶赛公司，人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院细胞库。

1.2 试剂 T4 DNA ligase、BamH I、Hind III、Sal I和Pst I均为 NEB产品，琼脂糖胶回收试剂盒为TaKaRa产品，脂质体转染试剂盒 LipofectamineTM2000购自Invitrogen，MMLV反转录酶和Taq聚合酶购自Promega，质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate，NADPH/NADP+)测定试剂盒为Bioassay产品;D-5-磷酸核糖二钠盐、5-磷酸木酮糖、磷酸甘油醛异构酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH)、5’5’-二硫代双硝基苯甲酸(5’5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid，DTNB)、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)等均购自Sigma;牛血清蛋白标准及其它化学试剂为国产。

1.3 仪器 引物设计软件为Primer 5.0，电泳仪为北京六一公司产品，可见-紫外分光光度计为Shimadzu产品，超声粉碎匀浆器由宁波新芝科器研究所生产。

2 方法

2.1 细胞培养 人HepG2细胞用含10%FBS的DMEM培养液，于37℃、5%CO2、湿度饱和的条件下进行培养。每2～3 d传代1次，传代时用0.25%胰蛋白酶(含0.1%EDTA)进行消化。

2.2 载体的构建及鉴定 参照文献［8］，将pEGFPC1-U6质粒和合成靶向TKTL1的siRNA用足量的BamHⅠ和HindⅢ双酶切消化，低融点琼脂糖凝胶电泳后回收大片段;将上述2个回收片段在T4连接酶作用下，22℃连接反应过夜;各取2 μL连接产物转化感受态DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB平皿上，37℃恒温过夜，从平皿中各挑选3个单克隆菌落于3 mL含卡那霉素抗性的LB培养液中，37℃、270 r/min摇床培养过夜;用质粒纯化试剂盒提取质粒，并做PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定，构建成功的质粒能被切出1条400 bp大小的DNA带。最后再挑选鉴定正确的克隆进行DNA测序分析。

2.3 重组质粒转染HepG2细胞及阳性克隆的筛选应用LipofectamineTM2000脂质体载体介导方法将本室构建好的pEGFP-C1-U6/TKTL1质粒转染至HepG2细胞［8］。细胞用胰酶消化，计数，取2个6孔板铺板:1～3孔为转染pEGFP-C1-U6/TKTL1质粒的HepG2细胞(转染组)，4～6孔为转染pEGFP-C1 -U6/UC质粒的细胞(质粒对照组)，7～9孔为未做任何转染处理的细胞(未转染组)。转染48 h后，采用G418进行逐步筛选，筛选8周后获得稳定克隆。

2.4 转染细胞mRNA表达的检测 将稳转细胞在常规条件下连续培养36 h，收集细胞并以冷PBS清洗后采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，用Oligo(dT)18及M-MLV将其逆转录成cDNA。取逆转录产物进行PCR扩增，TKTL1的上游引物为5’-TAACACCATGACGCCTACTGC-3’，下游引物为5’-CATCCTAACAAGCTTTCGCTG-3’，扩增条件为94℃45 s，58℃40 s，72℃40 s，扩增产物为150 bp。同时设β-actin为内参照，β-actin的上游引物为5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物为5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，扩增条件为94℃45 s，63℃40 s，72℃ 40 s，扩增产物为186 bp。

2.5 细胞内转酮醇酶(transketolase，TKT)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)活性的测定 将稳转细胞在常规条件下连续培养36 h，收集细胞并以冷PBS清洗后在冷裂解缓冲液(50 mmol/L Tris–HCl，150 mmol/ L NaCl，1%Triton X-100，100 mg/L苯甲基磺酰氟，5 mg/L亮抑酶肽，5 mg/L抑肽酶，中0℃裂解30 min，10 000 r/min离心15 min。取上清采用Bradford法进行蛋白定量，参照文献［9］用速率法测定G-6-PD活性，用Bradford定量法进行蛋白定量，酶活性单位以U/(g protein)表示。参照文献［10］用动态速率法测定TKT活性，酶活性用每分钟生成产物的量(ng)与细胞总蛋白(mg)的比值来表示。实验均重复3次，取3次实验的平均值。

2.6 细胞内乳酸、GSH及NADPH/NADP+测定 取上述稳转细胞裂解液的上清液，分别参照试剂说明书用比色法测定乳酸含量及NADPH/NADP+比值，参照文献［11］测定GSH含量。乳酸及GSH含量均用mmol/g蛋白表示。实验均重复3次，取3次实验的平均值。

3 统计学处理

结果

1 siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因后其mRNA表达的变化

siRNA质粒转染组、质粒对照组和未转染组的HepG2细胞培养36 h后提取RNA，RT-PCR检测TKTL1 mRNA表达水平。以未转染组细胞TKTL1与β-actin mRNA表达之比设为1.0，其它细胞与其对比分析。如图1所示，siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因后，其mRNA表达下降达60%左右。

Figure 1.Effect of RNA interference on TKTL1 mRNA expression in HepG2 cells.Non-transfection:no plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA:siRNA plasmid transfection.±s.n=3.##P＜0. 01 vs non-transfection.图1siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因后对对其mRNA表达的影响

2 siRNA沉默TKTL1基因对TKT活性的影响

选择siRNA质粒转染组和质粒对照组、未转染组的HepG2细胞培养36 h后测定细胞内TKT活性。siRNA沉默TKTL1基因后TKT活性与未转染组和质粒对照组比较有显著下降(P＜0.01)，质粒对照组与未转染组TKT活性无明显变化，见图2。

Figure 2.Effect of RNA interference on TKT activity in HepG2 cells.Non-transfection:no siRNA plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA: siRNA plasmid transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs non-transfection.图2 siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因对TKT活力的影响

3 siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因对乳酸生成的影响

siRNA质粒转染组、质粒对照组和未转染组的HepG2细胞培养36 h后测定细胞内乳酸生成水平，以未转染组细胞乳酸水平为内参照。siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因后乳酸生成较未转染组细胞有显著下降(P＜0.01)，而质粒对照组与未转染组无明显变化，见图3。

Figure 3.Effect of RNA interference on lactate production in HepG2 cells.Non-transfection:no siRNA plasmid transfection;control:control plasmid transfection; siRNA:siRNA plasmid transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs non-transfection.图3 siRNA沉默TKTL1基因对乳酸生成的影响

4 siRNA沉默TKTL1基因对细胞内GSH水平的影响

以未转染组HepG2细胞内GSH水平为内参照，实验发现siRNA沉默TKTL1基因后胞内GSH水平较未转染组细胞有显著下降(P＜0.01)，而质粒对照组与未转染组无明显变化，见图4。

Figure 4.Effect of RNA interference on GSH level in HepG2 cells.Non-transfection:no siRNA plasmid transfection;control:control plasmid transfection;siRNA: siRNA containing transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs non-transfection.图4 siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因对细胞内GSH水平的影响

5 siRNA沉默 TKTL1基因对细胞内 NADPH/ NADP+的影响

siRNA沉默TKTL1基因后胞内NADPH/NADP+比值较未转染组细胞有显著下降(P＜0.01)，而质粒对照组与未转染组无明显变化，见图5。

6 siRNA沉默TKTL1基因对细胞G－6－PD活性的影响

siRNA将质粒转染组、质粒对照组和未转染组的HepG2细胞在常规条件下培养36 h后测定细胞内G-6-PD活性，结果发现3组细胞G-6-PD活性［(158.1±11.1)U/g、(144.1±11.5)U/g和(165.7±13.8)U/g］均无显著差异(P＞0.05)。

讨论

代谢转变是肿瘤细胞的普遍特点，研究表明，肿瘤细胞主要通过磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)的非氧化阶段获取核酸合成所必需的原料——核糖。TKT就是其中的关键限速酶，对肿瘤细胞利用葡萄糖的碳原子合成核苷酸起关键性作用［12］。人类基因组中转酮醇酶基因家族包括TKT基因和2个TKT相似基因，即TKTL1和TKTL2。其中TKTL1定位于Xq28染色体的一个短小片段，该片段包含了许多与肿瘤恶性转化和细胞周期有关的基因，在肿瘤发生发展上起到十分重要的作用。

Figure 5.Effect of RNA interference on NADPH/NADP+in HepG2 cells.Untransfection:no siRNA plasmid transfection;Control:control plasmid transfection; siRNA:plasmid containing siRNA sequences transfection.±s.n=3.##P＜0.01 vs untransfection.图5 siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因对细胞内NADPH/NADP+的影响

肿瘤组织TKTL1高表达如何与其转移特性联系起来一直是我们感兴趣的问题，但如果仅从TKTL1在肿瘤细胞中的催化功能来看尚不能建立TKTL1高表达与肿瘤转移特性之间的关系。因此，必须从代谢网络调节的视角来研究TKTL1高表达对其上、下游代谢造成的影响。

本研究发现，肿瘤和微环境之间的相互作用，可以启动和加快促进肿瘤生长的循环链，因此，是肿瘤发展的决定因素。例如Manda等［6］发现肿瘤细胞内氧化-还原状态的改变与肿瘤组织的临床分期密切相关。真核细胞抗氧化最主要的机制是谷胱甘肽循环，其结果是保证胞内有足量的GSH，细胞内GSH水平的维持主要依赖于 G-6-PD催化产生的NADPH。研究认为以G-6-PD为限速酶的PPP氧化支路所产生的NADPH对于基质脱附(matrix detachment)的肿瘤细胞存活是必需的，并最终帮助肿瘤细胞发生侵袭和转移［13］。另一方面，肿瘤细胞糖酵解产生的大量乳酸等酸性物质有利于肿瘤细胞的扩散及拓植新的组织，这些酸性环境既能导致周围细胞的坏死又能诱导新的肿瘤突变发生［14］。无论是肿瘤细胞内抗氧化能力还是肿瘤周围环境中的酸性物质均与肿瘤发生转移密切相关，同时它们均与肿瘤内葡萄糖代谢有关，即TKTL1异常高表达可能会导致这些物质水平的变化，从而产生有利于肿瘤转移的微环境。因此，本文将以人肝癌细胞(HepG2)为代表通过siRNA沉默TKTL1基因研究其对肝癌细胞乳酸生成及抗氧化能力的改变。

本研究发现，通过siRNA技术沉默HepG2细胞TKTL1基因后，TKTL1 mRNA表达下降60%左右，TKT活性明显下降，TKT活性的下降同样造成乳酸生成减少、细胞内GSH及NADPH/NADP+比值显著降低。有意义的是，本文还发现通过siRNA技术沉默HepG2细胞TKTL1基因后细胞内抗氧化能力下降但G-6-PD活性并无明显变化，这与我们前期通过下调G-6-PD表达的研究结果不一致［11］。因此，我们推测本研究中肝癌细胞内GSH及NADPH/ NADP+比值显著降低可能并不是由于NADPH生成减少，而是细胞内代谢产生的活性氧簇(ROS)增多造成的。即下调肿瘤细胞TKTL1表达后不仅改变PPP中的非氧化阶段代谢，同时可能影响到有氧糖酵解或(和)葡萄糖在线粒体内的氧化磷酸化代谢。肿瘤细胞内过表达的TKTL1能通过调整葡萄糖的代谢，改善氧化-还原平衡状况、增加糖酵解并生成乳酸，从而改变肿瘤生长的微环境，导致其朝着有利于肿瘤细胞转移的方向转变。至于在葡萄糖的代谢调节网络中TKTL1是如何影响及通过什么机制影响葡萄糖代谢通路将是下一步需要研究的内容。

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