慢病毒介导的靶向沉默胰岛素样生长因子1型受体的siRNA对人子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响*

万 璟， 李小毛△， 舒珊荣， 张 宇

(1中山大学附属第三医院妇科，广东广州510630;2广州华侨医院妇产科，广东广州510632)

子宫内膜癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，近年来国内外发病率均有上升趋势。尽管多数子宫内膜癌为分化较好的腺癌，早期诊断和早期治疗预后好。但一旦发生肿瘤的侵袭和转移后，患者治疗效果和预后都明显较差，据统计，发生转移后子宫内膜癌患者的5年生存率不到25%［1］。探讨子宫内膜癌细胞转移和侵袭的机制，找到新的治疗靶点对子宫内膜癌具有十分重要的意义。

胰岛素样生长因子(insulin－like growth factor，IGF)系统在许多恶性肿瘤中起着重要的作用，并与子宫内膜癌的发生发展有关。IGF－1与其受体(insulin－like growth factor type 1 receptor，IGF－1R)结合，激发自身磷酸化，导致下游的有丝分裂原激活的蛋白激酶通路及磷脂酶－3蛋白激酶激活，进而引起细胞的增殖和肿瘤的转移。IGF－1R在一些肿瘤中过度表达。这些受体的过度表达，外源性肽类使肿瘤细胞转化为不依赖于支持物生长的类型［2］。研究发现IGF－1R与肿瘤的侵袭和转移有关，IGF－1能促进乳腺癌细胞的运动，进而促进肿瘤细胞的转移［3］，采用反义技术阻断IGF－1R的表达，能够抑制鼠前列腺癌细胞的生长及转移［4］。但IGF－1R对子宫内膜癌迁移和侵袭能力的作用仍然未知。本实验旨在利用RNA干扰技术沉默IGF－1R基因的表达，观察其对子宫内膜癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。

材料和方法

1 细胞培养

DH5α菌株，购自Promega。HEK293T细胞、人子宫内膜癌HEC－1B细胞购自中国科学院上海细胞库，均采用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养液(含青霉素1×105U/L和链霉素100 mg/L)培养，用含0.02%EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。传代后取对数生长期细胞作为实验对象。

2 主要试剂

特级胎牛血清、Opti－MEM I培养基和胰蛋白酶购于Gibco;RNA提取物Trizol购于Invitrogen;Reverse Transcription System试剂盒购于TaKaRa;PCR引物由上海生工生物工程公司合成;Matrigel购于BD;Transwell小室购于Corning;MTT购于Sigma。pGCSIL－GFP质粒载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司，pEGFP－N1－3FLAG质粒载体购自Becton Dickinson。鼠抗人IGF－1R购自Cell Signaling Technology;鼠抗 β－actin多克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology;细胞总蛋白提取试剂盒购自Pierce;蛋白分子质量Marker购自Fermentas。

3 siRNA设计、合成和筛选

根据IGF－1R基因序列和siRNA设计原则，设计5对siRNA序列。具体如下:siRNA1:5’－GCCGATGAGTGAGAAGACC－3’;siRNA2:5’－GCACGTCGAAGAATCGCAT－3’;siRNA3:5’－CGTTCTTTCAGCATCGAAC－3’;siRNA4:5’－CCATCAACAATGAGTACAA－3’;siRNA5:5’－GCATCACCGTTTACTACAA－3’。合成工作委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成，利用工具细胞HEK293T筛选出3条片段有沉默作用，选取其中沉默效果最好的1条进行慢病毒包装扩增，并转染子宫内膜癌HEC－1B细胞，根据real－time PCR和Western blotting结果验证其沉默效果。吉凯基因慢病毒载体系统由pGC－LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体3质粒组成。pGC－LV载体中携带用于研究的PTEN基因，并带有GFP标记。

4 病毒载体稳定转染

转染前1 d将细胞接种到6孔板(2×105cells/ well)，待第2 d细胞密度为40%～50%进行转染;将每个6孔板中的旧培养基吸尽，用不含血清的培养基洗涤1～2次;然后每个6孔板中加入1.5 mL的无血清培养基;HEC－1B细胞按感染复数(multiplicity of infection，MOI)为50进行慢病毒转染，分别设对照组(HEC－1B－CON)、目的基因病毒转染组(HEC－1B－KD)及阴性病毒转染对照组(HEC－1B－NC);转染8 h后将无血清培养基换为含10%胎牛血清的培养基继续培养。

5 Real－time PCR检测

转染后5 d，用Trizol抽提总RNA，变性电泳，测定A260及A280值，调整总RNA浓度为1 g/L，－80℃保存备用。根据IGF－1R、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases－2，MMP－2)和基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinases－9，MMP－9)序列设计合成引物，β－actin为内参照(表1)。先以总RNA为模板进行逆转录反应，然后以 cDNA为模板采用TaKaRa的real－time RT－PCR试剂盒在ABI 7700荧光PCR仪上进行real－time RT－PCR反应，PCR反应条件为预变性95℃ 10 s，95℃5 s，60℃ 30 s，40个循环。Real－time PCR扩增完毕进行熔解曲线分析，采用相对定量法以β－actin为内参照，利用Ct值计算各基因mRNA的相对量。目的基因mRNA相对表达量用2－ΔCt来表示(ΔCt由目的基因的Ct值减去β－actin的Ct值)。

表1 IGF－1R、MMP－9和MMP－2的引物序列Table 1 .The primers for IGF－1R，MMP－9 and MMP－2

6 Western blotting检测

转染后第7 d，提取1×106个细胞的蛋白，紫外分光光度计定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜上，常规进行免疫印迹实验操作，IGF－1R兔抗1∶1 000和β－actin兔抗1∶1 000稀释及羊抗兔Ⅱ抗抗体孵育，增强发光(ECL)显色。对膜上的免疫复合物条带进行分析，IGF－1R蛋白的相对表达水平为IGF－1R蛋白条带密度/β－actin条带密度。

7 平板集落形成实验

转染5 d后，将3组细胞按每个皿5 000个细胞密度接种到10 cm细胞培养皿中，置于37℃、5% CO2培养箱连续培养18 d后中止培养。细胞经甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下计数细胞克隆数。实验设3个平行样品，重复3次，结果取平均值。

8 细胞迁移实验

转染后第7 d，细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为1×108/L;使用Transwell小室，在下室加入600 μL含10%血清的培养基上室加入100 μL细胞悬液，继续在孵箱培养24 h;取出Transwell用PBS洗2遍，甲醇固定，室温20 min;加入结晶紫(0.1%)染色，室温0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下取10个随机视野计数，每个标本重复3次。

9 细胞侵袭实验

转染第7 d，提前准备好基质胶，将冻存于－80℃冰箱的BD Matrigel 4℃过夜(24 h)，变成液态;取无血清培养基，加入Matrigel(20%)，混匀(冰上操作)，加入上室，每孔100 μL;放入37℃培养箱中，孵育5 h;消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液;调整浓度为5×109/L;下室中加入10% FBS条件培养基;上室每孔加入100 μL细胞悬液;37℃培养箱中，孵育24 h;取出Transwell小室用PBS洗2遍，甲醇固定，室温20 min;加入结晶紫(0.1%)染色，室温0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下取10个随机视野计数，每个标本重复3次。

10 统计学处理

用SPSS 11.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 siRNA序列筛选

将HEK293T细胞作为实验筛选细胞，转染后提取RNA进行检测，结果见图1。筛选出siRNA1、2、4、5均能降低IGF－1R mRNA水平至30%以下，选取沉默效果最好的siRNA1进行慢病毒包装扩增。

Figure 1.Expression of IGF－1R mRNA in HEK293T cells after different siRNA transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs CON and NC.图1 转染后各组细胞IGF－1R mRNA的表达

2 细胞转染效率的检测

HEC－1B细胞转染后5 d可见较多特异性GFP绿色荧光的表达，表明我们的转染相对成功，见图2。

Figure 2.Expression of green fluorescent protein in HEC－1B cells 5 days after transfection(×100).图2 转染后5 d HEC－1B细胞绿色荧光蛋白的表达

3 转染siRNA后HEC－1B细胞中IGF－1R mRNA水平和蛋白水平的变化

在转染后第5 d，分别提取各组细胞的mRNA，进行检测验证其沉默效果，结果显示，siRNA1序列能使HEC－1B细胞的IGF－1R在mRNA水平下降81%。在转染后第7 d，提取细胞蛋白进行Western blotting检测，发现HEC－1B－KD组细胞IGF－1R蛋白水平下降91.5%(P＜0.05)，见图3、4。通过上述验证实验，证明靶点序列能有效降低HEC－1B细胞中IGF－1R的表达，保证后续实验的顺利进行。

Figure 3.Expression of IGF－1R mRNA in HEC－1B cells after transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1BCON and HEC－1B－NC.图3 转染后HEC－1B细胞IGF－1R mRNA的表达

Figure 4.Expression of IGF－1R protein in HEC－1B cells after transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1BCON and HEC－1B－NC.图4 转染后HEC－1B细胞IGF－1R蛋白的表达

4 慢病毒稳定转染后HEC－1B细胞克隆形成能力的变化

稳定转染后进行平板克隆实验检测细胞克隆形成能力，结果发现HEC－1B－KD组细胞形成克隆数目(153±11)明显少于HEC－1B－CON细胞(471 ±7)和HEC－1B－NC细胞(461±11)(P＜0.05)，而HEC－1B－CON与HEC－1B－NC组细胞之间没有明显差异，见图5。

Figure 5.Colony formation ability of HEC－1B cells after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.图5 转染后HEC－1B细胞的克隆形成能力变化

5 慢病毒稳定转染后HEC－1B细胞迁移和侵袭能力的变化

转染7 d后，HEC－1B－KD组迁移细胞相对于HEC－1B－CON组和HEC－1B－NC组明显减少(P＜0.05)，而HEC－1B－CON组和HEC－1B－NC组没有明显差异，见图6;HEC－1B－KD组侵袭细胞相对于HEC－1B－CON组和HEC－1B－NC组亦有明显减少(P＜0.05)，见图7。这些结果提示由于IGF－1R表达受到明显抑制，子宫内膜癌细胞HEC－1B的迁移和侵袭能力也受到不同程度的抑制。

6 慢病毒稳定转染后HEC－1B细胞MMP－2和MMP－9 mRNA水平的变化

慢病毒转染7 d后，HEC－1B－KD组细胞MMP－2及MMP－9 mRNA水平明显下降(P＜0.05)，分别下降了76%和86.5%，见图8。

Figure 6.Inhibition of HEC－1B cells migration after downregulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.图6 转染后HEC－1B细胞迁移能力的变化

Figure 7.Inhibition of HEC－1B cells invasion after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.图7 转染后HEC－1B细胞的侵袭能力变化

讨论

IGF是一类十分重要的生长因子，具有促进细胞增殖、分化等多种生物学活性，参与多种恶性肿瘤的发生与发展过程，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结直肠癌、肾癌、黑色素瘤等［5］。IGFs系统是一个庞大的家族，包括IGF－1、IGF－2及其受体IGF－1R、IGF－2R和至少6种胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF－binding protein，IGF－BP)。

Figure 8.Inhibition of MMP－2 and MMP－9 mRNA expression in HEC－1B cells after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.图8转染后HEC－1B细胞MMP－2和MMP－9的表达

IGF－1是酪氨酸激酶生长因子受体家族的成员，由细胞外的2个α亚单位及细胞内2个β亚单位通过二硫键结合形成的二聚体。一旦生长因子结合于该受体，受体β亚单位发生自身磷酸化，同时诱导胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)家族相应衔接蛋白的募集。其中IRS1的激活与肿瘤的增殖和凋亡有关，而IRS2与肿瘤的迁移和转移有关［6］。

IGF－1在多种肿瘤的发生发展过程中起重要作用，已成为肿瘤治疗的新靶点。很多研究数据表明，IGF－IR能调节肿瘤细胞的生长、增殖、代谢。对不同肿瘤的研究发现，抑制IGF－1R水平不仅影响裸鼠肿瘤的生长，还能影响肿瘤的转移。降低结肠癌细胞中IGF－1R的表达后，在裸鼠肝脏上成瘤率明显降低。而在过表达IGF－1R的胰腺癌裸鼠模型中，肿瘤的侵袭力和淋巴转移都显著增加。降低前列腺癌中IGF－1R的表达后肿瘤的生长和转移能力都明显被抑制。在最近的一项研究当中，使用抗IGF－1R表达的抗体作用于裸鼠模型，发现在不影响原发瘤生长的情况下，可以抑制肿瘤的远处转移。上述研究均提示IGF－1R在肿瘤的转移当中起着重要的作用［7］。

IGF－1R在子宫内膜癌中同样表达异常。Mc-Campbell研究发现高表达和活化的IGF－1R与子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌的发生密切相关［8］。Pavelié的研究发现IGF－1R在III、IV期子宫内膜癌中的表达显著高于I、II期及正常子宫内膜。提示IGF－1R可能与子宫内膜癌的发展有关［9］。本课题组先前研究过沉默IGF－1R表达对子宫内膜癌有增殖抑制作用，并能增加细胞凋亡［10］，但沉默IGF－1R是否能影响子宫内膜癌的侵袭和转移仍然未知。本实验采用RNA干扰技术，使用慢病毒载体，稳定沉默IGF－1R基因的表达，观察了IGF－1R水平降低对子宫内膜癌细胞侵袭能力的影响。结果提示，在细胞迁移实验中，KD组的细胞迁移能力显著下降，在基质侵袭实验中，转染组穿膜细胞较未转染组和载体对照组明显减少，具有显著意义。表明沉默IGF－1R表达可明显降低子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力。

MMPs是一类依赖Zn2+和Ca2+并可降解细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)的蛋白水解酶类［11］。其中MMP－2、MMP－9是MMPs超家族的重要成员，属明胶酶类，能降解明胶、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、弹力纤维等，其能通过蛋白水解酶的作用降解间质结缔组织和基底膜成份，还可以对生长因子、细胞表面受体、细胞黏附分子或趋化因子的剪切作用来影响肿瘤细胞的生物学行为，在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用［12－13］。MMP－2和MMP－9与子宫内膜癌的的侵袭转移有十分密切的关系，且随病理分级增高、肌层浸润加深及临床分期升高而呈增加趋势［14－15］。在我们的实验中，同时KD组中与侵袭转移能力相关的MMP－2和MMP－9水平明显下降，提示IGF－1R可能通过影响MMPs的水平来调节子宫内膜癌细胞的侵袭能力。

综上所述，特异靶向IGF－1R的干扰片段能有效抑制子宫内膜癌HEC－1B细胞内源性IGF－1R的表达，降低IGF－1R的表达能抑制子宫内膜癌的迁移和侵袭能力，同时能影响MMP－2和MMP－9的水平。IGF－1R可能成为抑制子宫内膜癌发生、发展、侵袭的的分子治疗靶点。

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