miR－21通过下调PTEN增强人脑胶质瘤细胞对卡莫司汀耐药*

胡 婷， 陈梅香， 翁泽平， 谢思明， 钟雪云

(暨南大学医学院病理学系，广东广州510632)

脑胶质瘤是脑内最常见的原发性肿瘤，侵袭性强、恶性进展快，目前，主要采取外科手术联合放、化疗的综合策略进行治疗。卡莫司汀［carmustine，1，3 -bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU］是一种烷化剂，属于亚硝基脲类药物，因其高脂溶性和易于通过血脑屏障的特性，被公认为是治疗脑胶质瘤的标准化疗药物［1］。然而，原发性耐药和获得性耐药的产生已成为其化疗失败的主要原因。原发性耐药和获得性耐药的机制复杂且不尽相同，目前相关研究多集中在原发性耐药方面，获得性耐药的具体机制尚不太清楚。

近年来，发现了一类具有转录后调控作用的小分子、非编码的微小RNA(microRNA，miRNA)在肿瘤中异常表达，并能以癌基因或抑癌基因角色参与肿瘤发生发展。人类成熟miRNA至少调控着30%的人类蛋白质编码基因。miRNA在胶质瘤的发生、发展以及耐药等过程中也具有重要作用。具有原癌基因作用的微小RNA-21(microRNA-21，miR-21在脑胶质瘤中常呈过度高表达状态［2］，其能影响细胞增殖能力及细胞对多种化疗药物的敏感性，但miR-21在人脑胶质瘤耐BCNU过程中的作用和机制尚不清楚。另外，本实验室从人脑胶质瘤细胞系SWO38中克隆出两株亚系SWOZ1(BCNU原发性耐药株)和SWOZ2(BCNU敏感株)，并通过BCNU诱导SWOZ2获得了SWOZ2-BCNU细胞株(BCNU获得性耐药株)［3-4］。本研究通过实时荧光定量 PCR (real-time fluorescence quantitative PCR，RFQPCR)检测SWOZ2及SWOZ2-BCNU细胞中miR-21表达水平并分析其与细胞对BCNU敏感度的关系;通过转染上调SWOZ2中miR-21的表达，进一步探讨miR-21在脑胶质瘤对BCNU产生获得性耐药过程中可能的作用及机制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要材料和试剂 BCNU为天津药业公司产品;CCK-8(Cell Counting Kit-8)为日本同仁公司产品;Trizol试剂为Invitrogen产品;PrimeScriptTM逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒均为TaKaRa产品;miR-21和U6 snRNA的Bulge -LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer Set为广州锐博公司产品;miR-21 mimics和miRNA mimics negative control为上海吉玛公司产品;jetPRIMETMTransfection

Reagent为Polyplus Transfection产品;第10号染色体同源缺失性磷酸酶及张力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p -Akt)兔抗人单克隆抗体均为Cell Signaling产品;P -糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)鼠抗人单克隆抗体、0.45 μm硝酸纤维素膜皆为Millipore产品;β-肌动蛋白(β-actin)鼠抗人单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记山羊抗兔IgG和 HRP标记山羊抗鼠 IgG均为 Protein Tech Group产品;BCA法蛋白质定量试剂盒为海门碧云天公司产品;ECL底物发光检测试剂盒为Pierce产品。1.2 主要仪器和设备 二氧化碳培养箱为Harris产品;倒置相差显微镜为Olympus产品;ELx800自动酶标仪为Bio-Tek产品;MiniOpticon Real-Time PCR System、垂直电泳仪和电转移仪均为Bio-Rad产品。

2 方法

2.1 细胞培养 人脑胶质瘤细胞株SOWZ2与SWOZ2-BCNU由本实验室建株并冻存保藏［3-4］，用含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI -1640培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化传代。

2.2 RFQ-PCR检测细胞中miR-21的表达 提取RNA:应用Trizol提取细胞的总RNA，经分光光度计检测，A260/A280值为1.8～2.1的用于cDNA合成。首先，逆转录反应:按说明进行，用PrimeScriptTM逆转录试剂盒，反应体系20μL，62.5 nmol/L miR-21及U6 Bulge-LoopTMmiRNA RT Primer各2 μL，反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。其次，RFQPCR:反应体系20 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，5 μmol/L Bulge-LoopTMmiR-21或U6 snRNA上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，无酶水7 μL，反应条件为95℃预变性20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃30 s，扩增40个循环。最后，所得数据用2-ΔΔCt评定不同细胞株miR-21相对表达量，ΔCt=CtmiR-21-CtU6，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。

2.3 CCK-8检测BCNU处理后胶质瘤细胞的存活率 将SWOZ2及SWOZ2-BCNU两种细胞在不含药物的培养基中培养48 h，以3 000 cells/well接种于96孔板中，每孔200 μL，24 h后待细胞贴壁加入BCNU，设7个呈2倍递增梯度浓度(2～128 mg/L)、1个不加药物的对照孔，各种药物浓度做3个平行孔。培养72 h后，加入10 μL CCK-8试剂，继续培养4 h后在酶标仪上检测各孔对波长为450 nm的吸光度(A)，计算细胞存活率，其计算公式为:存活率= (实验孔A值/对照孔A值)×100%，并通过软件计算出药物作用的半数抑制浓度(the half-maximal inhibitory concentration，IC50)。实验重复3次。

2.4 转染miR-21 mimics 取状态良好、对数生长期的SWOZ2细胞消化、计数，以平均每孔5.0×105个细胞种植于6孔板中。实验组加30 nmol/L miR-21 mimics、200 μL jetPRIMETMBuffer及4 μL jetPRIMETMReagent(命名为转染组或SWOZ2-miR-21 mimics);阴性对照组是将实验组中miR-21 mimics换为同浓度的miRNA mimics negative control，余同实验组(命名为对照组或SWOZ2-miR-control mimics);两组皆用含5%FBS的RPMI-1640。液调至2 mL。24 h后将培养液更换为含10%FBS的RPMI-1640，转染步骤严格按说明书执行。转染48 h后，提取各组细胞总RNA用RFQ-PCR检测miR-21表达量，或提取各组细胞总蛋白用Western blotting检测相关蛋白表达情况;或在转染24 h后消化细胞，并按3 000 cells/well接种于96孔板培养12 h，按以上方法用梯度浓度BCNU处理细胞48 h后用CCK-8检测各组细胞的存活率并计算IC50。

2.5 Western blotting检测胶质瘤细胞相关蛋白的表达 收集细胞，用RIPA细胞裂解液提取蛋白质样品。用BCA法在酶标仪上用570 nm波长测定总蛋白浓度。样本经过SDS-PAGE电泳后，再用电转仪以350 mA恒流1 h转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入PTEN(1∶1 000)、p-Akt (1∶1 000)、P-gp(1∶500)、内参照 β-actin (1∶2 000)，4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再加HRP标记Ⅱ抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化学发光试剂盒显影。

3 统计学处理

结果

1 miR－21在细胞中的表达

1.1 miR-21的表达 SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞中miR-21的表达量分别为1.000±0.079、2. 070±0.138，SWOZ2-BCNU细胞中miR-21的表达量明显高于SWOZ2细胞(P＜0.01)，见图1。

Figure 1.The relative expression of miR-21 in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by RFQ-PCR.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs SWOZ2.图1RFQ－PCR检测SWOZ2和SWOZ2－BCNU细胞中miR－21的表达

1.2 SWOZ2细胞转染miR-21 mimics后miR-21的表达 转染组miR-21的相对表达量(2 112.390 ±273.446)明显高于对照组(1.000±0.069)(P＜0.01)，见图2。

Figure 2.The relative expression of miR-21 in SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics for 48 h detected by RFQ-PCR.±s.n= 3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics(control).图2RFQ－PCR检测SWOZ2细胞转染miR－21 mimics或miR－control mimics 48 h后miR－21的表达

2 细胞对BCNU的敏感性

2.1 SWOZ2-BCNU细胞对BCNU的耐药性高于SWOZ2BCNU处理后SWOZ2-BCNU细胞的存活率高于SWOZ2细胞，见图3;BCNU对SWOZ2和SWOZ2 -BCNU细胞的IC50分别为(25.160±2.604)mg/L和(58.800±9.264)mg/L，SWOZ2-BCNU细胞对BCNU的耐药指数为2.34，明显高于SWOZ2细胞(P＜0.05)，见图4。

2.2 SWOZ2细胞转染miR-21 mimics后对BCNU耐药性的变化 转染组细胞的存活率高于对照组，见图5;BCNU对转染组和对照组细胞的IC50分别为(48.020±0.698)mg/L和(35.460±1.796)mg/L，转染组细胞对BCNU的耐药性明显高于对照组(P＜0.01)，见图6。

Figure 3.The viability of SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells treated with BCNU for 72 h detected by CCK-8 assay.±s.n=3.图3CCK－8检测BCNU处理72 h后SWOZ2和SWOZ2－BCNU细胞的存活率

Figure 4.The IC50of BCNU for SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells 72 h after treatment detected by CCK-8 assay.±s.n=3.*P＜0.05 vs SWOZ2.图4CCK－8检测BCNU处理72h后SWOZ2和SWOZ2－BCNU的IC50

3 Western blotting检测细胞中相关蛋白的表达

3.1 SWOZ2和SWOZ2-BCNU细胞中PTEN、p-Akt和P-gp蛋白的表达 与SWOZ2细胞相比，SWOZ2-BCNU细胞中PTEN蛋白表达量明显下降(P＜0.01)，而 p-Akt的表达量明显升高(P＜0.05)，P-gp的表达量也明显升高(P＜0.01)，见图7。

Figure 5.The viability of SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics 48 h after BCNU treatment detected by CCK-8 assay.±s.n=3.图5 CCK－8检测BCNU处理转染miR－21 mimics或miR－control mimics的SWOZ2细胞48 h后细胞的存活率

Figure 6.The IC50of BCNU for SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics 48 h after treatment detected by CCK-8 assay..n=3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics.图6 CCK－8检测BCNU处理48 h后对转染了miR－21 mimics或miR－control mimics的SWOZ2细胞的IC50

Figure 7.The relative expression of PTEN，p-Akt and P-gp in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by Western blotting. s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SWOZ2.图7 Western blotting检测SWOZ2和SWOZ2－BCNU细胞中PTEN和p－Akt的表达

3.2 转染miR-21 mimics对SWOZ2细胞中PTEN、p-Akt和P-gp表达的影响 与对照组相比，转染组细胞中PTEN蛋白表达量明显降低 (P＜0.01)，而p-Akt的表达量则明显升高(P＜0.01)，P-gp的表达量也明显升高(P＜0.01)，见图8。

该结果表明，在miR-21表达上调的细胞中PTEN蛋白表达下降，而p-Akt和P-gp蛋白表达增加。

Figure 8.The relative expression of PTEN，p-Akt and P-gp in SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics for 48 h detected by Western blotting.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics.图8 Western blotting检测转染miR－21 mimics或miR－control mimics 48 h后SWOZ2细胞中PTEN和p－Akt的表达

讨论

化疗是治疗人脑胶质瘤的一种重要手段，耐药性的产生是其治疗的重大障碍。肿瘤细胞的耐药性包括原发性耐药和获得性耐药。细胞耐药的主要机制包括:(1)多种糖蛋白介导的药物外排泵机制，包括P-gp、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-associated protein，LRP)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)等，这些蛋白均为能量依赖性药物外排泵，可将细胞内的药物转运出细胞，导致细胞内药物浓度减低而产生耐药。(2)酶介导的耐药机制，包括谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases，GST)，能催化药物与谷胱甘肽结合，形成水溶性较高的复合物，促进药物从体内排泄。拓扑异构酶Ⅱ(topoisomorasesⅡ，TopoⅡ)，能与药物结合，促进DNA断裂。蛋白激酶C能诱导多药耐药基因1(multidrug resistance-1，mdr1)表达，促进P-gp磷酸化。(3)凋亡调控基因介导的耐药，其中与耐药相关的基因有B淋巴细胞瘤2(B -cell lymphoma，bcl－2)、生存素(survivin)、骨髓细胞瘤癌基因(myelocytomatosis oncogene，c－myc);抑癌基因p53及PTEN等抑癌基因。(4)信号转导通路异常介导的耐药，如磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/ Akt)通路及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号转导通路激活导致的细胞多药耐药［5］。但有关耐药方面的研究多没有严格区分原发性耐药或是获得性耐药，有关脑胶质瘤对BCNU产生获得性耐药的机制依然不甚清楚。

新近的研究发现，具有转录后调控作用的小分子、非编码miRNA在细胞的分化、增殖、凋亡、胚胎发育等生命活动中具有重要作用，在肿瘤的发生、发展、侵袭、耐药以及诊断和预后等方面也具有重要作用。自1993年发现lin-4以来，目前，miRNA基因序列数据库(http://www.mirbase.org/Release 18: November 2011)已收录了动植物及病毒等成熟miRNA 18 226条，其中人类的为1 527条。

与小干扰RNA完全互补的作用方式不同，miRNA与靶mRNA的相互作用是以完全互补或部分互补的方式相结合的，一种miRNA可作用于多种mRNA，多个miRNA也可协同作用于同一个mRNA［6］。miRNA可能是基因调控网络的关键节点、可能是肿瘤治疗的有效新靶点。

在脑胶质瘤中，miR-21、miR-125b、miR-221、miR-222和miR-10b等17个miRNA呈过度高表达，而miR-7、miR-181a/b/c、miR-124、miR -137和 miR-128等33个 miRNA的表达下调［7-8］。具有原癌基因活性的miR-21位于染色体的脆性区域17q23.2。miR-21在乳腺癌、肝癌以及脑胶质瘤等多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的恶性分级正相关。在不同级别胶质瘤中，胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)中miR-21的表达上调最明显，miR-21可作为GBM的独立预后指标［9］。敲除GBM细胞中的miR-21，细胞生长受抑、凋亡增强、侵袭能力减弱并可抑制肿瘤的发生。本研究通过RFQ-PCR分析发现，SWOZ2-BCNU细胞(BCNU获得性耐药株)中 miR-21的表达量较其亲本SWOZ2细胞(BCNU敏感株)明显升高。为进一步观察miR-21在胶质瘤细胞对BCNU耐药过程中的作用，本研究将miR-21 mimics和阴性对照序列分别转入SWOZ2细胞，继而用RFQ-PCR检测两组细胞miR-21的表达，发现:与对照组相比，转染组SWOZ2-miR-21-mimics细胞中，miR-21的表达显著上调，转染组细胞对BCNU的耐药性亦明显升高。这些结果表明，miR-21表达上调后可介导脑胶质瘤细胞对BCNU产生获得性耐药。相关研究也发现了类似的结果:Li等［10］在多形性胶质母细胞瘤中发现，抑制miR-21的功能可上调靶因子富亮氨酸重复序列相互作用蛋白1(leucine-rich repeat flightless-interacting protein 1，LRRFIP1)的表达，进而导致NF-κB的活化，导致胶质瘤细胞对化疗药物替尼泊甙敏感性增强;Shi等［11］在U87MG中发现，过表达miR-21可降低Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)和半胱氨酸蛋白酶 3 (caspase-3)的表达、降低Bax/Bcl-2的比值，进而抑制替莫唑胺诱导的凋亡。这些结果表明，脑胶质瘤中miR-21表达的上调可介导细胞对化疗药物耐药。

在遗传背景相同的细胞中，miR-21可能是通过转录后调控某些蛋白的表达进而介导细胞对BCNU发生获得性耐药。有研究发现，在肝细胞癌、乳腺癌等多种肿瘤中，抑癌因子PTEN是miR-21的直接靶标［12］。在脑胶质瘤，特别是高级别的脑胶质瘤中，PTEN基因常发生突变或缺失、PTEN蛋白表达常呈下调或缺失状态。PTEN蛋白是PI3K/Akt通路的负性调节因子，PTEN可参与引起脑胶质瘤对药物耐药［13］。本研究通过Western blotting分析发现，相对于亲本细胞SWOZ2而言，在miR-21高表达且耐BCNU的SWOZ2-BCNU细胞中，PTEN蛋白的表达明显下调，而p-Akt和P-gp的表达却明显上调。本研究进一步通过转染和相关分析，发现:与对照组相比，上调miR-21表达后的转染组细胞，不仅对BCNU的耐药性明显增强，而且其细胞中PTEN蛋白表达明显下调、p-Akt和P-gp蛋白表达明显上调。PTEN蛋白是PI3K/Akt通路的负性调节因子，转染组细胞PTEN蛋白表达下调后可激活PI3K/Akt通路并导致p-Akt表达上调。相关研究也发现:在乳腺癌、白血病中，miR-21能下调PTEN蛋白的表达进而引起细胞对化疗药物耐药［14-15］;激活p-Akt可上调P-gp进而引起胃癌细胞的多药耐药［16］。本研究结果和相关资料表明，在脑胶质瘤细胞中，上调miR-21可降低PTEN蛋白的表达、激活PI3K/Akt通路，继而上调P-gp表达，进而介导细胞对BCNU耐药。

BCNU上调miR-21表达的具体机制尚不清楚。BCNU可上调脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)进而增加细胞因子白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)等的释放［17-18］;信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在多种恶性肿瘤以及脑胶质瘤中高表达，IL-6可通过激活的STAT3靶向上调miR-21促进多发性骨髓瘤细胞的存活［19］。这些资料表明，BCNU或许可通过上调LPS、增加IL-6的释放继而激活STAT3，进而上调miR-21的表达。但在BCNU诱导耐药的SWOZ2-BCNU细胞中，miR-21的表达上调是否由LPS/IL-6/STAT3调控尚需进一步研究。

在胶质瘤中，miR-21还可靶向作用于基质金属蛋白酶抑制因子Kazal基序逆向诱导半胱氨酸丰富蛋白(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK)、金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)、程序性细胞死亡因子4、异质核核糖核蛋白K、转录激活型p63(transcription activation p63，TAp63)和LRRFIP1，参与调节p53、转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)、线粒体凋亡、NF-κB、Bcl-2、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)通路等［20］。总之，作为一种致癌基因的miR -21可参与调节多条信号通路中多种肿瘤相关蛋白的表达，进而促进细胞生长、抑制凋亡、提高肿瘤的耐药性;miR-21可能是基因调控网络中的关键节点，靶作用于miR-21或许能发挥“单击多靶”效应，miR-21可能是脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗的一个有效靶标。然而，miR-21在细胞内的分子调控网络是错综复杂的，细胞调控miR-21表达的具体机制仍有待深入探究。

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