全氟辛酸在小鼠肝脂质过氧化损伤中的作用

郎 朗，宋维平，季宇彬

(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076)

全氟辛酸是制造不粘材料过程中的一种基本加工助剂，以其优良的热稳定性、化学稳定性、高表面活性及疏水疏油性能，被广泛地应用于工业生产和生活消费领域［1］.随着环境科学界对全氟辛酸研究的日益深入，人们逐渐认识到全氟辛酸以及这类化合物具有难降解性、生物蓄积性和沿食物链在生物体内富集作用，其对生物体的危害作用也不容忽视［2］，本文从氧化损伤角度，对全氟辛酸诱导的肝脏毒性及其机制进行研究.

1 材料与方法

1.1 实验材料

全氟辛酸(上海富诺林精细化工有限公司);谷丙转氨酶(ALT)试剂盒;谷草转氨酶(AST)试剂盒;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒;还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒;丙二醛(MDA)试剂盒;考马斯亮蓝试剂盒(试剂盒均购自南京建成).

1.2 实验动物

昆明种小白鼠:雌鼠、雄鼠各20只，体重(20± 2)g，合格证为黑动字第POOl01006号，由黑龙江中医药大学实验动物中心繁殖提供.

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

取全氟辛酸纯品，制备成442.59 mg/kg即LD50的剂量，以植物油为溶剂.将小鼠分成四个剂量组灌胃，分别为空白组、1/16LD50、1/8LD50、1/ 4LD50.其中每组10只小鼠雌雄各半.

1.3.2 苏木精－伊红(HE)染色法观察小鼠肝脏病理学变化

小鼠连续灌胃14 d后断颈处死.取肝脏适量切成小块，用PBS冲洗后备用.将肝组织切成1 cm ×1 cm×1 cm大小，放入改良Davidson固定液(140 mL95%乙醇，62.5 mL冰醋酸，375 mL甲醛0.37 g/mL，422.5 mL蒸馏水，室温保存3个月)中室温固定48 h以上;脱水;石蜡包埋;切片;染色观察.

1.3.3 超氧化物歧化酶(SOD);还原型谷胱甘肽(GSH);丙二醛(MDA)测定

小鼠连续灌胃14 d后断颈处死.取肝脏组织1 g，按重量体积比加生理盐水制备成10%组织匀浆，2 000 r/min离心10 min，取上清备用.进行SOD、GSH、MDA的测定，按试剂盒要求进行操作.

1.3.4 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)测定

小鼠连续灌胃14 d后眼球取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清备用.进行ALT、AST、ALP测定，按试剂盒要求进行操作.

2 实验结果

2.1 苏木精－伊红(HE)染色法观察小鼠肝脏病理变化

HE染色切片结果显示在400倍镜下观察，空白组雌雄小鼠肝组织质地均匀，肝管肝窦纹理清晰，肝细胞质地均匀，细胞核完整.1/16LD50染毒组肝窦肝管明显变窄，肝细胞不完整，细胞核溢出.1/8LD50、1/4LD50染毒组肝管肝窦基本消失，肝小叶中心区的肝细胞有萎缩、变性、甚至坏死消失等改变.细胞胞浆内含有少量大小不等的脂肪滴，细胞核被挤至一边，有圆形空泡，见图1.

图1 HE染色切片观察全氟辛酸对小鼠肝脏的影响变化

2.2 SOD、GSH、MDA测定结果

实验结果显示，与空白组相比，高、中、低剂量染毒组小鼠组织匀浆中SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，GSH活性显著降低.均有统计学意义(P＜0.01)，如表1所示.

表1 全氟辛酸对小鼠肝组织匀浆中SOD、MDA和GSH的影响

2.3 ALT、AST、ALP测定结果

实验结果显示，通过灌胃染毒PFOA两周后，高、中、低剂量染毒组小鼠血清中ALT和AST活性明显高于空白组，而且均有统计学意义，如表2所示.低剂量组小鼠血清ALP活性与空白组相比显著升高，有统计学意义(P＜0.05).高、中剂量组与空白组相比ALP活性有升高趋势，但是没有统计学意义.

表2 全氟辛酸对小鼠血清ALT、AST和ALP活性的影响

3 讨论

SOD是体内非常重要的抗氧化酶和氧自由基清除剂，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度.GSH是肝细胞内主要的水溶性抗脂质过氧化物质，除了调节细胞内氧化还原反应外，GSH还有明显的解毒功能.上述三者能较好的反映体内氧自由基水平及脂质过氧化损伤程度［3－5］.本实验结果显示，高、中、低染毒组小鼠肝匀浆SOD活性显著低于空白组(P＜0.01)，MDA含量显著高于空白组(P＜0.01)，GSH含量显著低于空白组(P＜0.01).说明染毒组动物的抗氧化能力显著降低，致使自由基清除不足，发生过氧化损伤，脂质过氧化物在体内积蓄，所以MDA含量升高明显.

反映肝损伤严重程度的常用酶类有谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和血清中碱性磷酸酶(ALP).ALT主要存在于肝细胞原浆的可溶部分，ALT活性升高提示肝细胞遭到破坏，细胞膜通透性增强.AST主要存在于肝细胞线粒体中，AST活性提高提示线粒体损伤.所以ALT和AST是检测肝脏疾病的敏感指标.在正常情况下，肝细胞膜能将细胞内的酶保持在细胞内，维持肝细胞与肝窦状隙之间存在的一个明显酶浓度梯度.当外源性化合物和代谢过程中生成的自由基直接侵害肝细胞膜时，肝细胞膜有任何细微改变都影响其通透性，胞浆内ALT及AST向肝血窦溢出，并进入周围血流，血清ALT及AST活性增加，以ALT上升为主;若肝脏损伤严重导致线粒体受损，AST才会大量释出，使血清AST升高大于ALT.血清中AST活性越高，肝损伤则越严重［6－8］.本实验结果表明，与空白组比较高、中、低染毒组小鼠血清中ALT和AST活性均明显升高(P＜0.01)，说明PFOA能够引起小鼠肝细胞膜结构和功能的损伤，同时导致小鼠肝细胞线粒体的损伤.实验结果显示，低剂量组小鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)活性与空白组比较显著增多，有统计学意义(P＜0.5)，而高、中剂量组ALP活性与空白组相比没有统计学意义.可能是由于肝内ALP主要位于胆管区，远离肝窦，即使肝损伤ALP成为可溶性，其进入胆汁的量也远多于进入血中的量［9－10］.

以上结果显示，PFOA能够使机体抗氧化能力显著降低，致使自由基清除不足，发生过氧化损伤，脂质过氧化物在体内蓄积，破坏了细胞膜和线粒体膜的通透性导致小鼠肝损伤.

［1］ CALAFAT A M，NEEDHAM L L，KUKLENYIK Z，et al.Perfluorinated chemicals in selected residents of the American continent［J］.Chemospherem.，2006，63(4):490－496.

［2］ 胡存丽，仲来福.全氟辛烷磺酸和全氟辛酸毒理学研究进展［J］.中国工业医学杂志.2006，6(12):354－358.

［3］ FAMTONE J C，WARD P A.Pole of Oxygen derived free frdicals and metabolites in leukocyte dependent inflammatory reactions［J］.Am J pathol.，1982，107(3):395－418.

［4］ CROSS C E.Oxygen radicals and human disease［J］.Am Inter Med.，1987，107(4):526.

［5］ IMITH M T，THOR H，HARTZEU P，et al.The treatments of lipid peroxidationin isolated hepatocytes［J］.Biochem pharmacol.1982，8:18－26.

［6］ 王宝恩，张定凤.现代肝脏病学［M］.北京:科学出版社，2003:182.

［7］ BOHME M，MULLER M，LEIER I，et al.Cholestasis caused by inhibition of the adenosine triphosphate－dependent bile salt transport in rat liver［J］.Gastroenterology，1994，107:255－265.

［8］ LU S C，TSUKAMOTO H.Role of abnormal methionine metabolism in alcoholic liver injury［J］.Alcohol.，2002，27(3): 15562.

［9］ LIEBER C S.Alcoholic fatty liver:its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis［J］.Alcohol.，2004，34(1):9－19.

［10］ 张 昭，郎 朗，季宇彬.HPLC对雌性小鼠血清全氟辛酸质量浓度分析［J］.哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2011，27(6):794－795，827.