疯草内生真菌研究现状与存在问题

周启武，白 松，路 浩，赵宝玉，陈基萍

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100； 2.西藏农牧厅畜牧技术推广总站，西藏 拉萨 850000)

疯草(Locoweed)是豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)中能引起家畜以慢性神经机能紊乱为特征中毒症状的有毒植物统称[1]，其种类多，抗逆性强，在荒漠草原上生长旺盛，且返青早，枯萎迟，分布广泛。其他牧草缺少或长势不好时，长期或大量采食疯草可引起大批动物中毒甚至死亡，称为“疯草中毒”(Locoism)。国外，疯草主要分布于美国、加拿大、墨西哥、俄罗斯、西班牙、冰岛、摩洛哥和埃及等国家，其中以美国西部最为严重。在我国主要分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海、西藏、新疆、四川和云南等省区。疯草现已成为世界范围内危害草原畜牧业最为严重的毒草，疯草毒性灾害被列入世界性“生态经济病”之一。自1873年美国首次报道疯草中毒以来，人们经过一百多年的研究，现已确证引起疯草中毒的主要毒性物质是吲哚里西啶生物碱苦马豆素(Swainsonine，SW)[2-3]。

内生真菌(Endophytic fungi)是指在其生活史中某一段时期内或整个生命时期生活于植物组织内部，对其宿主不引起明显疾病的一类真菌，包括腐生真菌、病原真菌和菌根菌[4]。19世纪末，Hanausek[5]、Vogl等[6]就首次报道过有内生真菌感染了黑麦草(Loliumtemulentum)的种子，但没有得到重视，直到20世纪30年代发生牲畜黑麦草中毒造成畜牧业重大损失，发现主要原因是采食了感染能产生生物碱毒素的内生真菌的黑麦草，内生真菌的研究才得以广泛深入地开展起来。经过一百多年研究，国外已由最初的发现、检测、分类和分离培养内生真菌，深入到内生真菌与宿主植物互作关系、抗性机制和群体特征以及代谢产物活性的研究。我国对内生真菌的研究起步相对较晚，最早见于1985年李扬汉[7]对不同种或变种毒麦籽实糊粉层以外菌丝层的有无，感染真菌的籽实与毒性的关系，内生真菌在分类学上的地位，感染来源以及真菌与寄主之间的关系所做的讨论。直到1994年邱徳有等[8]才首次报道从云南红豆杉(Taxusyunnanensis)树皮中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌。仅20年左右的研究历史，已引起真菌学、植物学、化学、药物学等学科的广泛关注。

1985年，美国学者Braun[9]首次从绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)中分离获得SW纯品，随后发现豆类丝核菌(Rhizoctonialeguminicola)和埃里砖格孢属真菌(Embellisiaspp.)也能产SW。因此，人们推测疯草内生真菌与SW之间有着极为密切的关系，并相继从多种疯草中分离到产SW的内生真菌。随着研究的深入，有关疯草内生真菌生物多样性、疯草内生真菌与SW合成关系、疯草内生真菌与疯草抗逆性以及SW毒理和药理活性等已成为国内外研究的热点。SW良好的抗肿瘤活性和免疫增强作用，目前国外二期临床试验已经完成[10]。我国疯草面积超过1 100万hm2，虽然为SW的研究和开发提供了充足的来源，但由于疯草中SW含量较低，提取技术有限，而且面临植物资源消耗造成草地沙漠化等严重生态问题，直接从疯草中提取SW已不是一种理想的方法。因此，通过生物发酵获取内生真菌次生代谢产物，扩大SW来源以及进行批量生产，已成为获取SW的新途径。为此，就国内外疯草内生真菌研究现状、经济价值以及存在问题等方面进行简要综述，为今后疯草内生真菌深入研究提供参考。

1 疯草内生真菌多样性、分布及定植规律

内生真菌广泛存在于自然界中，由于自然地理条件和宿主植物的差异，造就了植物内生真菌种属的多样性。Petrini[11]推测，每种植物平均有4～5种专性内生真菌，全世界内生真菌种类在100万种以上。孙剑秋等[12]报道，近十多年来人们已从47 科81属114 种3变种药用植物中分离到内生真菌达171属，涉及子囊菌、担子菌、接合菌、卵菌、有丝分裂孢子真菌及其无孢菌类等真菌类群。内生真菌多样性不仅表现于其在自然界中庞大的种属数量，而且同一植物的同一组织内内生真菌也存在多样性。从一种植物中可分离到的内生真菌通常为数种至数十种，有的甚至多达数百种，这些内生真菌的存在对维持生态系统的平衡发挥着重要作用。疯草具有地理分布的广泛性和种类多样性，因此其内生真菌也呈现生物多样性特点，多年来人们已从疯草中分离出多种内生真菌(表1)。

目前，国内外所分离到的疯草内生真菌主要是埃里砖格孢属(Embellisiaspp.)，此属真菌种类繁多，自然界分布较广泛，生境非常复杂，一些种还能够引起植物的病害。Li和Nan[28]报道，沙打旺埃里砖格孢菌(E.astragali)能引起直立黄芪(Astragalusadsurgens)黄矮根腐病，是导致其早衰的主要原因。但至今未发现埃里砖格孢属真菌能引起与其共生的疯草类植物发生病变。

卢萍[25]对中国内蒙古3种疯草中SW相关因子研究表明，菌丝体在疯草种子中密度最高，主要分布于糊粉层中，胚组织内分布很少，在植株营养器官中，以近地面茎基部组织中菌丝体密度最高，其次为叶鞘。Braun等[16]从11个疯草种群中的8个分离到产SW的埃里砖格孢属内生真菌，发现叶子侵染率为72.9%、茎97.2%、种子93.1%、花100%。说明疯草内生真菌在侵染植株定植时具有一定的组织选择性，可能是由于不同组织营养成分的差异或通过种子向植株传播过程的缺陷造成。此外，不同植株内生真菌的种类、基因型是不相同的，内生真菌对宿主植物也具有选择性，同一种内生真菌与一种植物能形成内共生关系，而与另外一种植物就无法形成内共生关系，这可能与植株生长环境以及宿主植物基因型差异有关。

2 疯草内生真菌检测、分离鉴定与菌种保藏

Patriquin和Döbereiner[29]1978年用光镜观察四唑减少巴西玉米和其他牧草根际环境细菌时发现，苯胺蓝可将真菌原生质体染成蓝色，于是建立了最初的苯胺蓝染色检测植物组织内生真菌的方法，此法简便易行, 至今仍广泛使用。此外，一些先进技术手段如酶联免疫分析、近红外反射光谱分析也被用于定量检测，有人也以内生真菌代谢物如麦角碱等作为指示剂测定内生真菌[30]。目前，分子生物学方法如PCR特异扩增技术也能快速、准确检测植物内生真菌的存在。Cook等[19]成功应用qPCR方法从美国3种疯草中检测到内生真菌的存在，方法简便、快速，检测限达到0.2 pg·ng-1总DNA，大大提高了植物中内生真菌检测水平。

植物内生真菌分离方法已很成熟，且成功用于疯草内生真菌的分离[14,23，31]。对于内生真菌种属鉴定，通常是在传统形态学鉴定的基础上，结合真菌核糖体rDNA-ITS保守序列测定完成的[32]。卢围等[29]从采自内蒙古的小花棘豆样品的茎和花中分离到两株产SW的内生真菌，经形态学与核糖体rDNA-ITS序列测序鉴定为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)。但随着研究的深入及更多菌株的发现，传统的rDNA-ITS分类方法由于其较低的分辨率已不能满足菌株精细鉴定的需要，现已利用6～7个基因片段从多基因系统发育学的角度对某一真菌个体进行精确的定位分类[33-34]。

为保证菌株在保藏过程中纯度、活性、基因信息的完整性，避免菌株变异和降低退化，目前适用的真菌保藏方法主要有3种[35]：1)不断将菌株移植在新鲜培养基上，并在适宜条件下生长，随后置于低温(4～10 ℃)环境中让其连续生长，主要包括斜面移植、油管保藏和蒸馏水保藏法等。2)利用干燥环境(空气、硅胶、土壤、沙子等)保藏菌株休眠体(分生孢子、厚垣孢子等)。3)通过脱水降低细胞内水分或低温冷冻抑制菌株代谢活性以达到长期保藏，包括冷冻干燥法、低温冻结和液氮保藏法等。其中，第1种是目前疯草内生真菌保藏过程中最常采用的方法，且多以斜面移植后低温保藏[21,25,27]。

表1 国内外疯草内生真菌的种属多样性

3 疯草内生真菌与疯草互作关系

疯草-内生真菌-家畜的关系集中反映了草地农业生态系统中植物与微生物、植物与动物、微生物与动物之间错综复杂的关系(图1)。对此，不同学者持不同的见解，有的将其描述为内生真菌与宿主植物互惠互利的共生关系[37]；有的则认为是特殊的寄生关系，而这种寄生一般不引起植物相关病症，当植物衰老或受到环境胁迫时又会变成病原菌而引起植物病害，即内生真菌与疯草之间是一种处于动态平衡的拮抗关系[38]。正是疯草-内生真菌共生体的双重特性，尤其是内生真菌-疯草共生关系对植物的影响显著，已引起国内外学者广泛关注[2,39]。

图1 疯草-内生真菌相互作用及其对家畜的影响(改自南志标和李春杰，2004[36])

3.1内生真菌促进疯草生长发育 Ralphs等[14]从部分棘豆属和黄芪属植物中分离到内生真菌，其感染程度与SW含量呈正相关，而未检测出内生真菌的棘豆属和黄芪属植物，经GC-MS检测，SW含量甚微，说明内生真菌(Embellisiaspp.)能够增加SW的生物合成。Valdez Barillas等[17]研究绢毛棘豆与SW关系表明，当土壤中缺乏氮元素时，无根瘤菌与有根瘤菌绢毛棘豆植株SW含量从0.084%提高到0.114%，最高达到0.175%，这主要是根瘤菌固氮作用产生天冬氨酸在植物体内转化为赖氨酸被内生真菌用来合成SW，并发现大量内生真菌分布于光合作用强、赖氨酸浓度高的植物叶茎的叶绿体中，较好地解释了叶绿素多的棘豆茎、叶中SW含量较高的原因。卢萍[25]研究发现，在植物(Astragalusoxyphysus)和真菌(Rhizoctonialeguminicola)中SW的合成都是通过相同途径由六氢吡啶羧酸(Pipecolic acid)而来，内生真菌的感染可能加强或补充了SW的产量。因此，疯草内生真菌促进植株生长发育主要体现在增加SW的合成方面。资料显示，疯草内生真菌感染程度与疯草毒素——SW生物合成量呈正相关(表2)。而且，Cook等[18,20]最近用LC-MS方法将疯草(绢毛棘豆、密柔毛黄芪和斑荚膜黄芪)分为含SW(SW>0.1%)和不含SW(SW<0.01%)的两大类群，并通过qPCR检测相应组织中内生真菌Undifilumoxytropis的含量，发现含有SW的疯草组织中内生真菌含量是不含SW疯草相应组织中的10倍(根部3倍)以上，而不含SW的疯草组织中检测不到内生真菌的存在；且组织中SW浓度与内生真菌含量的变化不一致，如密柔毛黄芪花冠中内生真菌含量(12.1pg·ng-1)比花(4.0pg·ng-1)中高，但花中SW浓度(0.26%)却比花冠(0.70%)中高许多。这说明内生真菌Undifilumoxytropis在疯草SW合成过程中起着主导作用，但可能因为内生真菌在植物活组织中移行分布而导致检测出组织中SW浓度与内生真菌含量变化不一致。

表2 疯草中内生真菌感染量与苦马豆素浓度的关系[15]

3.2内生真菌增强疯草抗逆性 资料表明，内生真菌侵染还可增强宿主植物的抗逆性[38]，疯草多生长于干旱、半干旱地区，一般具有耐寒、耐旱、生命力强、繁殖率高等特点，局部地区盖度和生物量均超过其他牧草，这与疯草-内生真菌互惠互利的共生体存在密切相关[40]。Richardson等[41]发现，在干旱胁迫下，感染内生真菌的高羊茅植株叶片和叶鞘中通过积累更多的渗透调节物质多元醇(甘露醇、阿拉伯糖醇)以及葡萄糖和果糖来提高植株的渗透势和再生能力，而在未感染植株中，这些物质含量相对较少。另外，感染内生真菌植株偏重于根系生长，未感染植株则偏重于地上部分生长[42]。有发达的根系，抗旱能力就更强，而且其叶片更加宽厚，卷曲更严重，能有效避免水分蒸发，从而提高植株的抗旱性[43]。Castillo等[44]评估不同温度条件下水分胁迫对疯草种子萌芽的影响，结果表明，夏秋季节密柔毛黄芪在荒漠草地低湿土壤条件下并不影响其萌芽。Ralphs等[14]研究疯草中SW与内生真菌(Embellisiaspp.)间的关系时发现，当疯草-内生真菌共生体在干旱胁迫或低pH值环境生长时，SW含量会显著增加，且生长在干旱环境的疯草比对照组植株更高更茂盛，其干质量明显高于对照组。程翠等[45]发现，在渗透胁迫和磷胁迫情况下内生真菌均可促进小花棘豆幼苗生长。此外，内生真菌还能产生或协同疯草产生有毒生物碱-SW，致使食草动物(主要是山羊和绵羊)一般都不愿采食疯草类植物，因而导致疯草大量生长，优质牧草却被过度采食，致使草地供养能力下降。因此，疯草-内生真菌共生体从生物胁迫与非生物胁迫两方面都增强了疯草的抗逆性，以致草原出现毒草化，严重破坏了草原生态及影响畜牧业的发展。

4 疯草内生真菌经济价值

内生真菌的物种多样性决定了其代谢产物的多样性。大量研究结果表明，植物内生真菌可产生多种生物活性物质，在这些代谢产物中，有些是与宿主相同或相似的生物活性物质，有些是新物质，具有特殊的生理功能[12]。现已证明疯草中SW含量与内生真菌感染程度呈正相关，并已从疯草中分离到可产生SW的内生真菌，说明SW是疯草内生真菌的次生代谢产物[14,27]。

SW具有抗肿瘤、抗病毒感染、增强免疫、抑制肿瘤细胞转移及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性[46-48]。Dennis等[49]首次报道SW单用或结合α-干扰素能抑制体内HT29结肠癌生长，其抗癌作用在于SW对肿瘤细胞的直接杀伤和提高机体免疫功能的双重作用。SW还具有刺激骨髓细胞增值分裂的活性，同时具有抗辐射活性，能降低放疗治疗癌症时对患者的副作用[50]。陈绍淑等[51]用SW对人胃癌生长及转移的试验证明，SW具有明显的肿瘤抑制作用。SW盐酸盐对小鼠肿瘤的生长和转移也表现出抑制作用。刘文明等[52]研究了SW对MDV感染鸡血液学指标的影响，结果显示，SW能够维持试验鸡白细胞水平，使试验鸡能更好地防御MDV的侵害。Tanaka等[53]采用SW抑制α-甘露糖苷酶的特性，从而阻止副流感病毒(HPIV3)表面蛋白的初步合成，抑制病毒糖基化修饰而达到抗病毒作用。美国已经把SW及其衍生物作为抗艾滋病病毒药物进行了研究[54-55]。研究发现，在小鼠衰竭的NK细胞中，SW并不对肿瘤细胞转移产生影响，说明SW抑制肿瘤细胞转移的机制可能是增强免疫系统的作用[54]。

虽然SW良好的抗肿瘤活性和增强免疫作用已引起人们的关注，但因SW来源匮乏问题一直制约着SW药理活性研究与开发的进程。从疯草植物中分离筛选产SW的内生真菌，通过微生物发酵生产SW具有很大的发展前景，生物发酵与植物提取和化学合成相比具有成本低，不易造成草原生态破坏，发酵条件易控制，且对环境污染较小等优点。Mclain-Romero等[13]从绢毛棘豆、密柔毛黄芪、兰伯氏棘豆的叶、茎、花及种子中分离的内生真菌在人工培养条件下均可单独产生SW。Braun等[16]从美国疯草中分离到可以产生SW的内生真菌埃里砖格孢菌(Embellisiaspp.)，通过体外发酵培养，从其代谢产物中检测出SW，有内生真菌的植物种群含SW，且内生真菌与宿主植物中SW水平高度相关。余永涛等[21,24]、卢萍等[56]、Li和Nan[28]也分别从甘肃棘豆(O.kansuensis)和小花棘豆(O.glabra)中分离得到同一种棘豆埃里砖格孢菌(Embellisiaoxytropis)，这说明我国疯草中也可能含有产SW的内生真菌，有望科研工作者从我国疯草中分离筛选出产SW的内生真菌，并通过工艺发酵合成SW，为其临床应用及相关研究提供充足的来源。

此外，内生真菌及其代谢产物在农业方面也具有很好的应用前景，如植物生长调节剂、品种的培育和改良、生物防治等[57]。疯草主要分布于温带高寒、干旱半干旱地区，对恶劣环境有很好的抗性，这与内生真菌感染程度相关[40]。现已明确，疯草致毒的主要原因是埃里砖格孢属内生真菌的侵入[58]，并且Ralphs等[15]也证实疯草内生真菌几乎是通过垂直传播(母系传播)到下一代的。因此，可以利用疯草与内生真菌之间的关系，采取适当措施控制疯草内生真菌，为动物疯草中毒病的防治和疯草资源的合理利用提供新思路。例如，采用克隆特异性功能基因等生物技术，对有毒埃里砖格孢属内生真菌进行脱毒变异，人工接种到疯草植株上，改疯草为有益牧草，改良牧草品质和微生物特性，创造新种质[59]。目前，美国、澳大利亚、新西兰和欧洲一些国家的种子公司都提供内生真菌感染率高的牧草种子，经调查这些植物的抗性(抗旱、抗寒、抗病虫害等)相对于其他未感染内生真菌的植物要高[60]。

5 存在问题

尽管人们在疯草内生真菌的生态分布、分离鉴定、菌种保藏及代谢产物等方面做了一些工作，但疯草内生真菌还存在诸多问题有待人们去解决。

1)内生真菌研究手段和方法有待提高，包括内生真菌的检测、分离和鉴定等。据目前研究来看，疯草中分离到的内生真菌绝大部分是埃里砖格孢属，很难揭示疯草中内生真菌多样性。其原因可能是有些内生真菌不能在人工培养基上生长，或有些快生型内生真菌抑制了慢生型内生真菌的生长，不能将生活在疯草内的所有真菌全部分离出来，且有些已分离到的内生真菌在人工培养基上不产生可育性孢子，就会由于菌丝体的死亡而造成菌种丢失而难以鉴定菌种类型，因此不能准确地反映出疯草内生真菌的数量和种群。

2)疯草内生真菌的来源及入侵宿主的分子机理仍不明确。目前虽知道疯草内生真菌主要是通过垂直传播，其次一些产孢真菌的成熟孢子可通过外界环境传播到其他植株。但关于疯草内生真菌到底是由植物细胞内的细胞器(如叶绿体等)演变而来，还是通过植物感染(根际土壤或空气感染)外界真菌后形成共生体以及此共生体的形成机制，目前仍没有试验证实，也没有成熟的分子机制作为其理论依据。

3)内生真菌与宿主的关系及内生真菌对疯草组织的专一性、分布等生命活动机理研究较少。对内生真菌与疯草之间关系的研究，目前主要集中在内生真菌对疯草SW含量的影响方面，但对于内生真菌如何增强疯草的抗逆性及在种群中的竞争优势研究较少；其次内生真菌分布于植物体内，并在定植组织时具有一定的选择性，致使有些内生真菌可以在宿主科的水平上具有专一性，有的在宿主种的水平上具有专一性[37]，对于内生真菌在植株内和植株间分布特点、机理的研究报道相对较少，也有待于进一步深入探讨。

4)内生真菌产生与疯草相同的生物活性物质——SW的遗传机制还不清楚。目前，国内外关于疯草内生真菌产生与疯草相同的生物活性物质SW，是因为内生真菌从宿主植物获得了相关基因的直接传递而具有了相同的次级代谢产物合成途径，还是因为内生真菌与其宿主植物经长期的共同生活，相互之间的影响使得某些基因可以在植物与内生真菌之间相互作用过程中发生传递的遗传机制还不清楚。此外，疯草埃里砖格孢菌是近年来豆科植物上首次发现的内生真菌[61]，且现已证实其能够单独或协同疯草产生SW，而对于其他含有埃里砖格孢菌的植物如直立黄芪(A.adsurgens)体内是否含有SW，以及疯草埃里砖格孢菌侵染其他植物后是否可以产生SW尚未见报道，均有待于进一步研究。

总之，我国疯草类植物资源极为丰富，面积约有1 100万hm2以上，每年造成10亿元的经济损失，美国每年仅因家畜采食绢毛棘豆和密柔毛黄芪就造成2.34亿美元的损失[62]。但疯草毒素——SW却有诱人的医用价值，因此，如果能够解决上述问题，探明疯草内生真菌及其共生体产生SW的生理、生化机制，不仅可为预防动物疯草中毒的发生，减少对畜牧业造成的经济损失，以及保护草原群落多样性具有重要现实意义，而且可为利用疯草内生真菌生产SW提供理论依据，促进SW在临床医学上的普遍使用，以造福人类。

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