百合属‘普瑞头’的组织培养和快速繁殖

张彦妮，李文英

(东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

百合为百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)，有很高的观赏性,是高档切花之一[1]。百合‘普瑞头’(L.asitichybridscv. Prato)为亚洲杂种系百合[2]，株高平均约为83.3 cm，花朵直径平均约为15.6 cm，碗型，橘红色，无香味，抗寒性高，能在东北地区露地越冬[3]。由于抗寒性强，‘普瑞头’是培育抗寒百合新品种的重要杂交亲本，所以，对其的研究主要集中在花粉生活力的测定、远缘杂交以及百合远缘杂交的胚囊和胚胎发育及胚拯救等方面[4-8]。目前，对百合的组织培养和扩繁也有研究，但相对较少[9-10]。本研究以亚洲百合品种‘普瑞头’鳞茎为材料，设置不同激素种类和浓度，以期完善‘普瑞头’鳞片组织培养再生体系，为其生产扩繁、脱毒复壮、基因转化等工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 亚洲百合品种‘普瑞头’的鳞茎取自东北林业大学园林学院花卉研究所。

1.2方法

1.2.1无菌材料的获得 洗去‘普瑞头’鳞茎表面的泥土，除去有病斑和机械损伤的鳞片，取中外层无病斑的鳞片，放入三角瓶中，加入适量洗衣粉，然后放在自来水下冲洗3～4 h，在超净工作台上用无菌水冲洗3次，再用75%酒精消毒20～30 s后用无菌水冲洗3遍，放入0.1%升汞溶液中，滴入2～3滴吐温消毒8 min，期间不断摇晃，再用无菌水冲洗5～6次。用无菌滤纸吸干鳞片表面的水分。把鳞片切成0.5 cm×0.5 cm左右的小块接种在MS培养基附加不同浓度6-BA(0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mg·L-1)和NAA(0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mg·L-1)的培养基中。采用鳞片内侧向上平放的接种方式，每个处理3个重复，定期统计不定芽的分化情况。

1.2.2再生小鳞茎鳞片诱导 待再生小植株上的小鳞茎直径超过0.5 cm时，取中外层，接种在MS培养基附加不同浓度6-BA(0、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg·L-1)和NAA(0、0.05、0.50、1.00、1.50 mg·L-1)的培养基中，每个处理3个重复，一个月后观察记录诱导分化结果。

1.2.3生根壮苗 待组培苗约2 cm高时，切取长势好、无根的苗，接种到生根培养基(MS+0.05 mg·L-1IBA、MS+1.00 mg·L-1IBA、MS、1/2 MS+0.05 mg·L-1IBA、1/2 MS+0.50 mg·L-1IBA、1/2 MS+1.00 mg·L-1IBA、1/2 MS+2.00 mg·L-1IBA、1/2 MS)上，一个月后统计生根率、平均生根数。

1.2.4炼苗移栽 将生根后的组培苗进行炼苗移栽，先打开三角瓶口的封口膜，经过1 d后，取出并洗净根部附着的培养基，移栽到蛭石中，15 d后移栽到沙和土壤混合壤土中，30 d后统计成活率。

1.3培养条件 所有培养基都采用固体MS培养基,培养基中蔗糖30 g·L-1、琼脂8 g·L-1，pH值为5.8～6.0。1/2 MS培养基中，大量元素减半，pH值不变。培养温度为(25±2) ℃，日光灯光源，光照强度2 000～3 000 lx，光照时间10～12 h·d-1。

1.4数据分析 不同激素、培养基对组培效果影响用Statistica 7.0中的多因素方差(Factorial ANOVA)分析进行。

2 结果与分析

2.1‘普瑞头’鳞片在不同激素组合培养基上的分化效果 将鳞片消毒后接入到培养基上，结果发现，刚接入的外植体为乳白色，15 d左右基部略有膨大，20 d 左右开始出现淡黄绿色愈伤组织，主要集中在鳞片外侧靠近培养基处。鳞片的下部容易形成愈伤，上部和中部大多没有明显的愈伤组织生成。外植体多直接形成小鳞茎状突起，然后分化成不定芽(图1)。结果表明(表1)，培养基中只加NAA时，在浓度为0.05 mg·L-1时分化率最高(55.56%)。培养基中只加6-BA，浓度为1.5 mg·L-1时分化率最高(66.67%)，但平均分化芽数少于浓度为1.0 mg·L-1时的分化率。当6-BA浓度为1.5 mg·L-1时，不定芽呈丛状生长，生长较弱，有畸形芽出现。同时添加6-BA和NAA，能明显促进不定芽的生成，诱导率高于单独添加6-BA和NAA。在培养基MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA上分化率最高(85.00%)，且平均每块分化的芽数最多(3.60个)。所以，诱导小鳞茎的最适宜培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。方差分析结果(表2)表明，不同浓度6-BA和NAA组合对外植体分化率和平均芽个数影响显著。

2.2不同激素浓度对再生小鳞茎鳞片分化的影响 再生小鳞茎鳞片的再生能力较强，20 d左右即可分化出小苗，诱导率均达到100%。结果表明(表3)，单独添加6-BA时，浓度在1.0 mg·L-1时不定芽分化数最多(4.67个)，植株长势良好(图2)；单独添加NAA时,随着NAA的浓度增大，平均生成的根数增多，但是诱导的芽数减少且出现畸形根，NAA的浓度为0.5 mg·L-1时平均生成的芽数最多(3.58个)，且小苗生长健壮；同时添加6-BA和NAA时，6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，诱导的苗长势不佳，黄色且畸形，6-BA浓度为0.5 mg·L-1、NAA的浓度为0.05～0.50 mg·L-1时，诱导率和产生的芽数都很高，随着NAA浓度增大生成的根数增多，但当NAA的浓度达到1.00 mg·L-1时生成的芽数较少且诱导的苗长势不佳，根出现畸形；既能获得数量很多的不定芽又能直接用于生根移栽的最适培养基为MS+0.5 mg·L-1NAA，诱导不定芽的最适培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA。方差分析结果(表4)表明，6-BA和NAA浓度对再生小鳞茎鳞片的芽个数、生根率、生根系数影响显著。

图1 鳞片上诱导出的愈伤组织和丛生芽Fig.1 Callus and adventitious buds induced from bulbscale

表1 不同浓度6-BA和NAA组合对‘普瑞头’鳞片分化能力的影响

表2 6-BA和NAA浓度对‘普瑞头’鳞片分化能力影响的方差分析结果

图2 生长良好的丛生芽Fig.2 Cluster-shoots growing well

2.3生根培养 当丛生芽长为2 cm左右时，把丛生芽分成单株，接种到生根培养基中诱导生根，7 d后接种到含有IBA的培养基上的多数单株都有根生成，30 d后，观察记录根的生长状况。结果表明(表5)，1/2 MS培养基对于生根的影响好于MS培养基。IBA能促进生根，随着IBA浓度升高，生根率及平均根数都明显增加。但IBA浓度达到0.5 mg·L-1时苗的叶尖就出现白化现象，浓度超过1.0mg·L-1时，叶尖白化且苗的生长状况不佳，萎蔫且根畸形。所以，最适的生根培养基为1/2 MS + 0.5 mg·L-1IBA(图3)。方差分析结果(表6)表明，基本培养基、IBA浓度对生根率和生根系数影响显著。

表3 不同激素浓度对再生小鳞茎鳞片分化的影响

表4 6-BA和NAA浓度对再生小鳞茎鳞片分化影响的方差分析结果

表5 基本培养基和IBA浓度对丛生芽生根的影响

图3 丛生芽的生根

2.4组培苗的驯化及移栽 打开三角瓶的封口，1 d后小心取出生根的无菌苗，洗净其根部的培养基，移栽到蛭石中，遮阴处理，注意通风保湿，15 d后把无菌苗从蛭石中取出放入壤土(壤土和沙的比例为2∶1)中，无菌苗的成活率超过85.0%，且移栽后生长状况良好(图4)。

图4 移栽成活的苗Fig.4 Survival seedlings after transplanting

3 讨论与结论

百合不同部位的鳞片不定芽的分化能力不同，外层、中部鳞片的分化能力大于内部鳞片[11-12]，所以本研究直接采用外中层鳞片作为外植体进行不定芽诱导。外源生长素和细胞分裂素是细胞离体培养所必需的激素，合适的浓度和种类的适宜配比不但可以诱导细胞分裂和生长，而且能控制细胞分化和形态建成[13]。不同激素组合对百合鳞片诱导分化不定芽的能力存在差异[14]，培养基中只加6-BA，浓度为1.0 mg·L-1时的分化率高且平均分化芽数最多。这与周蕴薇等[10]的研究结果相同，但是分化率及分化系数低于其结果，这可能是因为升汞比次氯酸钠对鳞片的毒害作用大。培养基中6-BA与NAA的适宜搭配，可使芽的诱导和增殖达到最高比率。但是6-BA与NAA的比例不能过高，否则会导致诱导率极低[15]。6-BA质量浓度过高会使部分鳞片产生不定根，抑制不定芽的生成，植株细弱，不利于再生植株的正常发育[16-17]。本研究中当NAA和6-BA的浓度超过1.5 mg·L-1时不定芽的诱导率比较低且出现畸形芽，证实了这一理论。

表6 培养基和IBA浓度对丛生芽生根影响的方差分析结果

再生小鳞茎鳞片的诱导效果及诱导周期短，分化能力强，可以作为百合组培再生体系较好的外植体，愈伤的诱导率较高且愈伤的质量较好。诱导无菌小鳞茎鳞片生成不定芽数量多且生长健壮的培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA。而在MS附加NAA 0.5 mg·L-1的培养基上诱导出的不定芽及生根多，且植株生长健壮，可直接用于生根移栽，且大大缩短了育苗周期。1/2 MS培养基比MS培养基的生根效果好，这和前人的研究结果相一致[18-19]，可能是由于MS培养基含有较高浓度的无机盐而抑制了不定根的形成。IBA对生根有促进作用，但IBA过高，根的数量过多，抑制根的伸长，容易发生老化现象。崔刚等[20]对樱桃(Cerasuspseudocerasus)、苹果(Maluspumila)等进行瓶外生根，未生根的苗木得到了充分的利用，所以也可以尝试用瓶外生根的方式缩短百合育苗周期。

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