急性脑缺血再灌注大鼠海马CA1区细胞凋亡与β-catenin、GSK-3β蛋白表达的关系

刘 斌，董晓柳，张文彦，张晋霞

(河北联合大学附属医院，河北唐山063000)

研究表明，缺血脑损伤后存在细胞凋亡，细胞凋亡是脑缺血再灌注(IR)损伤时缺血脑区迟发性神经元死亡的主要形式［1］。Wnt信号通路在许多生理过程中发挥重要作用，参与多种细胞发育和细胞死亡调节［2］。目前，关于Wnt 信号通路的关键信号分子β-连环蛋白(β-catenin)和糖原合成酶激酶3β (GSK-3β)蛋白在急性脑IR损伤脑组织细胞凋亡中的作用少见报道。2010～2011年，我们观察了急性脑IR损伤大鼠海马CA1区细胞凋亡的表达及其与β-catenin、GSK-3β蛋白表达的关系，旨在探讨Wnt通路与缺血性脑损伤的关系，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康雄性SD大鼠36只，体质量200～250 g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。兔抗大鼠GSK-3β多克隆抗体、兔抗大鼠βcatenin多克隆抗体购自北京博奥森生物公司;原位末端标记(TUNEL)试剂盒购自北京中杉金桥生物公司;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白购自华美生物公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及脑IR建模 实验前，先将大鼠放在室温(23±2)℃、自然光照下自由进食喂养2周;然后随机分为假手术组6只、脑IR组30只;脑IR组又分为IR后3、6、24、48、72 h 5个亚组，每组6只。参照改良的Longa法［3］、线栓法制作大鼠大脑中动脉阻断再灌注模型。各组术前12 h禁食、4 h禁水。大鼠取仰卧位，用10%水合氯醛行腹腔麻醉后，在其颈部行常规纵行切口约25 mm，暴露并钝性游离右侧颈总动脉(CCA)，结扎同侧CCA近心端和颈外动脉(ECA)分叉处，并反向拉直ECA;在距CCA末端约5.0 mm处剪口，将直径0.26 mm的鱼线沿颈内动脉(ICA)方向插入，遇阻力后稍退0.5 mm，插入深度由ECA分叉处计算约18.5 mm;在ICA近心端结扎该动脉，全层缝合切口，2 h后拔出鱼线实现再灌注，术中室温保持(22±2)℃。脑IR建模成功的标志为大鼠苏醒后左侧肢体瘫痪，提尾时左前肢内收屈曲，爬行时左侧划圈。假手术组线栓插入深度小于9.0 mm，不闭塞大脑中动脉。

1.2.2 脑组织标本制备 在规定时间内，用多聚甲醛经大鼠心脏灌注、固定后取脑。取海马部位脑组织，先后行常规乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、连续切片5 μm厚，再置60℃烤箱烘烤0.5 h，直至载玻片上的蜡呈泪滴状流下。

采用Western blotting蛋白印迹法制作标本，用10%水合氯醛对大鼠进行深度麻醉。断头后于冰上开颅取脑，用冷PBS漂洗残余血，立即分离新鲜海马，将海马组织置于15 mL离心管中，12 000 r/min离心15 s;加入4℃预冷的组织裂解液，振荡混匀、作用30 min后，将细胞悬液置4℃低温离心12 000 r/min，离心10 min后取上清液4℃保存。经蛋白定量后分装，用4℃预冷的PBS调整蛋白浓度为750 μg/mL，加等体积上样缓冲液，在沸水中至少煮5 min，置于4℃备用。

1.2.3 细胞凋亡检测 取海马组织标本，经DAB显色、苏木素轻度复染后，采用TUNEL法、TUNEL试剂盒提供的步骤检测各组细胞凋亡情况。细胞凋亡阳性标准:细胞核中有棕黄色颗粒为阳性细胞。

1.2.4 β-catenin、GSK-3β蛋白阳性细胞检测 取制备好的海马组织标本，加入正常羊血清封闭液中，先后滴加一抗4℃过夜、滴加二抗和适量辣根酶标记链霉卵白素工作液，进行DAB显色。采用免疫组化法，按试剂说明书操作要求检测各组β-catenin、GSK-3β蛋白表达。细胞质着棕黄色为阳性细胞。

1.2.5 β-catenin、GSK-3β蛋白表达量检测 采用Western blotting蛋白印记法检测β-catenin、GSK-3β蛋白表达量。取各组制备好的海马组织20 μg，在100 g/L十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，电转移至硝酸纤维素膜，以标准蛋白Marker为参照，根据相对分子质量大小切取相应条带，分别加入兔抗大鼠 β-catenin一抗(1∶175)、兔抗大鼠GSK-3β一抗(1∶175)，4℃过夜。次日，在室温放置20 min、用 TBST洗涤，分别与生物素标记二抗(1∶200)室温下孵育0.5 h，TBST洗涤，与卵白素—辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5 h，DAB显色。实验重复3次，以β-actin作为内参，进行特异性蛋白条带扫描;在同一条件下，应用CMIAS真彩医学图像分析系统测定条带光密度值，其与β-actin灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.2.6 图像分析 选定各组缺血侧海马CA1区，用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统计数阳性细胞。在200倍光镜下观察切片，随机取6个视野，计数每个视野海马CA1区长度为1 mm的阳性细胞数，以平均值代表各区阳性数结果。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，数据以s表示，两组间均数比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析和SNK-q检验，两变量间关系分析用Spearman秩和相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡数、GSK-3β蛋白、GSK-3β蛋白表达阳性数比较 术后24 h，假手术组海马CA1区可见凋亡阳性细胞。IR组IR 3 h即出现凋亡细胞，随着IR时间延长逐渐增加，至48 h达高峰，72 h开始减少。与假手术组比较，IR组各时间点的细胞凋亡数明显增多(P均＜0.01)。见表1。术后24 h，假手术组海马CA1区可见β-catenin、GSK-3β蛋白表达。IR组各时间点均可见β-catenin、GSK-3β蛋白表达，从3 h即出现，48 h达高峰，72 h开始减少。与假手术组比较，IR组各时间点细胞凋亡数、GSK-3β蛋白阳性数明显增加(P均＜0.01)，β-catenin蛋白阳性数均增加，但无统计学差异(P均＞0.05)。见表1。

表1 各组细胞凋亡数、β-catenin蛋白、GSK-3β蛋白表达阳性数比较(个，s)

表1 各组细胞凋亡数、β-catenin蛋白、GSK-3β蛋白表达阳性数比较(个，s)

注:与假手术组比较，*P＜0.01

组别 n 细胞凋亡 β-catenin GSK-3β IR 3 h 6 16.33±1.63* 3.07±1.50 9.47±1.92* IR 6 h 6 18.33±1.75* 3.14±1.08 9.92±1.09* IR 24 h 6 21.67±2.16* 3.26±0.88 11.08±0.89* IR 48 h 6 25.83±1.47* 3.47±0.94 11.21±1.56* IR 72 h 6 23.83±0.98* 3.19±1.02 10.58±1.64假手术组*

2.2 各组β-catenin、GSK-3β蛋白表达量比较 假手术组海马CA1区可见β-catenin、GSK-3β蛋白表达;IR组再灌注3 h β-catenin、GSK-3β蛋白表达量升高，再灌注48 h达高峰，72 h开始下降。与假手术组比较，IR组各时间点的β-catenin蛋白表达量明显升高(P均＜0.01);GSK-3β蛋白表达量升高，但无统计学差异(P均＞0.05)。见表2。

表2 各组β-catenin、GSK-3β蛋白表达量比较(s)

表2 各组β-catenin、GSK-3β蛋白表达量比较(s)

注:与假手术组比较，*P＜0.01

组别 n β-catenin GSK-3β 6 0.99±0.18 1.18±0.02 IR组IR 3 h 6 1.01±0.29* 1.34±0.09 IR 6 h 6 1.10±0.12* 1.40±0.07 IR 24 h 6 1.11±0.17* 1.48±0.02 IR 48 h 6 1.16±0.22* 1.62±0.09 IR 72 h 6 1.06±0.23*假手术组1.43±0.07

2.3 相关性分析 对IR组大鼠的β-catenin、GSK-3β蛋白表达与细胞凋亡情况进行相关性分析，结果显示，大鼠脑IR后各时间点的细胞凋亡数与GSK-3β蛋白阳性表达数呈正相关(r=0.300，P＜0.05)，与β-catenin蛋白阳性表达数无相关性(r=0.160，P＞0.05)。

3 讨论

研究表明，细胞凋亡机制参与脑 IR损伤［4］。脑缺血时细胞凋亡机制非常复杂，其发生过程受多种蛋白和基因调控。调控脑细胞发育的关键信号传导通路包括Wnt信号通路、Hh信号通路、Notch信号系统及神经营养因子家族等，Wnt信号在中枢神经系统发育中起关键作用，对中枢神经系统轴线形成、海马发育、大脑皮质模式形成及细胞分化等均有重要作用;而且该信号通路还与其他信号系统相互作用，共同影响神经元发生、神经前体细胞分化、神经突触诱导、细胞周期调控及细胞凋亡调节等［5］。

β-catenin、GSK-3β蛋白是Wnt信号通路经典途径的两个关键信号分子。β-catenin在经典的Wnt信号通路中处于中心地位，其激活或降解会导致Wnt信号通路变化［6］。GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过激活糖原合成酶调节细胞能量代谢过程，在细胞的生长、分化、突变和凋亡等生命活动中具有重要的调控作用，是多种信号途径的交汇点，具有广泛的底物(包括多种转录因子)［7］，参与多种信号的负调控。研究表明，在多种正常组织细胞及多类肿瘤细胞中，GSK-3β活性上调可进一步激活细胞凋亡的相关蛋白激酶BAX、c-jun、Caspases家族［8，9］，从而诱导细胞凋亡。在心肌、脑缺血损伤中，GSK-3β活性增强可促进IR损伤脏器中的细胞凋亡［10］。大量研究证实，缺血可激活GSK-3β，GSK-3β表达增强可诱导细胞早期凋亡。本研究显示，IR组大鼠缺血侧海马CA1区可见细胞凋亡明显，GSK-3β蛋白表达明显增多，且GSK-3β蛋白表达数与细胞凋亡数呈正相关;而β-catenin蛋白表达则与假手术组无统计学差异。本研究结果与文献报道基本一致，进一步说明Wnt信号通路在脑IR损伤中可能发挥重要作用，GSK-3β蛋白对缺血性脑损伤的细胞凋亡起促进作用。

综上所述，Wnt信号通路的确参与了大鼠缺血性脑损伤过程，且该通路对细胞凋亡过程有促进作用。提示调节Wnt信号转导通路、修复脑缺血损伤，可能成为今后干预脑IR损伤的新途径。

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