不同用药顺序吉非替尼、多西他赛联用对非小细胞肺癌细胞的体外抑制作用

玄香兰，周彩存，安昌善

(1延边大学附属医院，吉林延吉133000;2上海市肺科医院)

为了使非小细胞肺癌(NSCLC)患者能从靶向药物和化疗中受益，目前正在寻找靶向治疗与化疗的最佳联合方案和时机。2011年，我们观察了不同顺序吉非替尼、多西他赛(DXT)联用对人肺癌细胞株PC-9、PC-9/G、A549细胞周期及凋亡的影响，旨在寻找抑制NSCLC生长的最佳联用方案

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株PC-9、PC-9/G、A549(上海肺科医院中心实验室);DMEM培养基、胰蛋白酶(鼎国生物);细胞凋亡试剂盒(BioVision公司);流式细胞仪分析细胞试剂盒(GenMed Scientifics公司);全自动酶标仪(芬兰)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将盛有PC-9(EGFR 19外显子突变吉非替尼敏感株)、PC-9/G(吉非替尼获得性耐药)、A549(吉非替尼原发性耐药)的液氮冻存管放入37℃水浴箱中快速融化，用PBS洗涤后移入培养瓶，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置5%CO2、37℃培养箱孵育，每周换液传代，保持其对数生长状态。吉非替尼原料用DMSO稀释成浓度50 μmol/mL的母液，避光、4℃保存，用药时DMSO终浓度小于0.1%。DXT 40 mg/mL避光、4℃保存，配制母液时以1∶3比例溶于13%乙醇中，加药后乙醇终浓度小于0.1%。

1.2.2 药物半数抑制浓度(IC50)检测 采用MTT法检测药物IC50。取100 μL含细胞数5×103个的细胞悬液，接种于96孔板;加入100 μL含不同浓度吉非替尼(浓度梯度5～50 μmol/L)或DXT(浓度梯度4～40 μg/mL)的培养液，72 h后每孔加入20 μL MTT 5 mg/mL，置细胞培养箱孵育4 h，1 200 r/min离心10 min，弃上清;每孔加DMSO 200 μL，置摇床上充分混匀1 h。最后用酶标仪测量波长530 nm时的光密度(OD)值，求出每组平均OD值，计算细胞存活率。细胞存活率=(每组平均OD值－试剂空白/对照组OD平均值－试剂空白)×100%。用细胞存活率作出量效曲线，用作图法得出两种药物对不同细胞的IC50。

1.2.3 不同用药顺序对细胞存活率的影响 取100 μL含细胞数5×103个的细胞悬液接种于96孔板。各组用药顺序:G→D组(即吉非替尼→DXT组)先加入100 μL含不同浓度的吉非替尼(PC-9、PC-9/G、A549终浓度分别为0.04、15、30 μmol/L)，24 h后加入10 μL含不同浓度的DXT(PC-9、PC-9/ G、A549终浓度分别为8、18、16 μg/mL)培养液;培养72 h后加入20 μL/孔MTT 5 mg/mL，置细胞培养箱孵育4 h，1 200 r/min离心10 min，弃上清;每孔加入DMSO 200 μL，摇床上充分混匀后，用酶标仪检测波长530 nm时的OD值，求出每组平均OD值。D→G组先加DXT，后加吉非替尼，PC-9、PC-9/G、A549终浓度同G→D组。G组单用吉非替尼;D组单用DXT;同时设空白对照组。实验重复3次，计算细胞存活率。细胞存活率=(每组平均OD值－试剂空白/对照组平均OD值－试剂空白)×100%。用细胞存活率作出直方图。

1.2.4 细胞周期检测 取1×105个对数生长期细胞接种于6孔板，24 h贴壁后弃培养液，用PBS清洗2遍，加入3 mL含不同浓度的吉非替尼或DXT培养液;24 h后加100 μL含不同浓度的吉非替尼或DXT培养液。实验分组、药物终浓度同细胞存活率检测方法。72 h后，用0.25%胰酶消化收集全部细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清;用冷PBS洗涤2次，加固定液1 mL、4℃固定2 h以上;离心后去上清，用冷PBS洗涤2次，加标记液500 μL(500 μL Assay Buffer+10 μL RNase A+10 μL PI)，避光、室温孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 细胞凋亡检测 其检测方法同细胞周期检测。加药72 h后，用0.25%胰酶消化收集全部细胞，1 500 r/min离心5 min后弃上清;用冷PBS洗涤2次，加500 μL Binding Buffer悬浮细胞、5 μL Annexin V-PE混匀，避光、室温反应5 min，过滤后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件，数据用s表示，细胞存活率比较用方差分析(oneway ANOVA)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同顺序吉非替尼、DXT联用对细胞存活率的影响 吉非替尼、DXT均能抑制PC-9、PC-9/G、A549生长，其作用呈浓度依赖性(见图1～3)。吉非替尼对PC-9、PC-9/G、A549的IC50分别为(0.05 ±0.008)、(27.2±2.0)、(28.3±0.3)μmol/L，DXT分别为(12.8±1.9)、(21.4±1.1)、(14.5±0.2) μg/mL。各组不同细胞存活率比较响见表1。

图1 吉非替尼对PC-9的存活率—药物浓度曲线

图2 吉非替尼对PC-9/G和A549的存活率—药物浓度曲线

图3 DXT对PC-9、PC-9/G、A549的存活率—药物浓度曲线

表1 各组细胞存活率比较(%，s)

表1 各组细胞存活率比较(%，s)

注:与G组、D组比较，*P＜0.05;与G-D组比较，#P＜0.05

细胞 G组 D组 G→D组 D→G组PC9 42.1±1.8 45.4±1.8 34.8±0.2* 27.7±0.4*# PC9/G 57.6±0.2 63.8±2.3 50.0±2.9* 41.9±0.5*# A549 58.0±1.7 48.7±1.5 43.6±1.3* 34.5±1.1*#

2.2 不同顺序吉非替尼、DXT联用对细胞周期的影响 G组、G→D组PC-9、PC-9/G、A549的G0～G期细胞比例均较高，G2～M期细胞比例较少;D组、D→G组G2～M期细胞比例均较高，G0～G1期细胞比例较少。各组细胞周期细胞比例比较见表2。

表2 各组细胞周期细胞比例比较(%，s)

表2 各组细胞周期细胞比例比较(%，s)

注:与G组、G-D组比较，#P＜0.05

细胞 G组 D组 G→D组 D→G组PC9 G0～G175.7±4.9 20.1±4.5# 73.3±3.4 17.8±6.1# S 10.2±0.4 14.5±7.9 10.5±7.4 13.8±8.5 G2～M 13.6±4.3 65.4±3.5# 16.2±5.9 68.4±10.4# PC9/G G0～G180.0±7.0 19.9±4.6# 71.9±4.7 20.6±5.9# S 6.0±3.3 11.0±4.5 8.1±3.3 19.4±3.8 G2～M 13.8±7.7 69.1±3.1# 20.0±1.6 60.0±4.4# A549 G0～G170.5±8.2 18.0±2.0# 70.5±7.8 18.0±3.9# S 18.1±7.5 11.0±6.9 6.8±0.9 10.0±6.9 G2～M 11.5±1.1 71.0±6.9# 22.7±7.0 72.0±3.8#

2.3 不同顺序吉非替尼、DXT联用对细胞凋亡的影响 与G→D组比较，D→G组PC-9、PC-9/G凋亡率明显升高，A549凋亡率无统计学差异。各组细胞凋亡率比较见表3。

表3 各组细胞凋亡率比较(%，s)

表3 各组细胞凋亡率比较(%，s)

注:与G组、G-D组比较，*P＜0.05

细胞 G组 D组 G→D组 D→G组PC9 15.5±8.7 47.7±9.2*24.8±10.9 51.3±5.7* PC9/G 7.8±1.3 18.0±3.5* 9.2±3.5 21.6±1.1* A549 4.4±4.0 5.5±1.6 5.2±1.3 6.5±0.8

3 讨论

吉非替尼是选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，是最常用的治疗NSCLC的分子靶向药物，对女性、非吸烟、EGFR突变的腺癌患者疗效显著［1］。DXT是治疗NSCLC的一、二线化疗药物。体外研究发现，吉非替尼可抑制细胞生长，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡［2］;DXT可促进细胞凋亡［3］;EGFR-TKIs可增强化疗药物抑制肿瘤细胞生长的作用［4］。但临床试验发现，同时应用吉非替尼、DXT两类药物的NSCLC患者生存率并未延长［5］。

本研究显示，PC-9、PC-9/G、A549对吉非替尼和DXT均呈浓度依赖性，药物浓度越高，细胞存活率越低;吉非替尼、DXT联用抑制细胞增殖的效果均强于单药;先用DXT或吉非替尼都有协同作用，但先用DXT抑制细胞增殖的效果优于先用吉非替尼，其原因可能与两药作用机制不同有关。吉非替尼可影响细胞信号传导通路，使细胞增殖阻滞在G0～G1期;DXT主要作用在微管形成阶段，使细胞增殖阻滞在G2～M期。如受到外界因素影响，细胞生长周期无法到达微管形成阶段，DXT就不能完全发挥抑制细胞生长的作用，这可能是吉非替尼拮抗DXT的原因。本研究显示，与G→D组比较，D→G组PC-9、PC-9/G细胞凋亡率明显升高;提示吉非替尼可促进DXT诱导的凋亡，给予DXT前先用吉非替尼，可降低DXT的凋亡，说明凋亡可能为两药协同或相互拮抗的原因之一。Mahaffey等［6］研究发现，单用DXT或者先用DXT、后用厄罗替尼处理的NSCLC细胞，可明显表达凋亡相关蛋白;而单用厄罗替尼或先用厄罗替尼、后用DXT处理的细胞则无凋亡相关蛋白表达;提示细胞凋亡是引起两类药物顺序差异的重要原因，但其药物凋亡作用相互拮抗的机制尚待进一步研究。

总之，本研究显示先用DXT、后用吉非替尼是较理想的抑制NSCLC细胞增殖的最佳联用方案，无论原发性、获得性吉非替尼耐药患者，均可能在此方案中获得最大利益。

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［2］Huether A，Hopfner M，Sutter AP，et al.Erlotinib induces cell cycle arrest and apoptosis in hepatocellular cancer cells and enhances chmosensitivity towards cytostatics［J］.Journal of Hepatology，2005，43(4):661-669.

［3］Mhaidat N，Zhang XD，Jiang CC，et al.Docetaxel-induced apoptosis of human melanoma is mediated by activation of c-Jun NH2-terminal kinase and inhibited by the mitogen-activated protein kinase extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway［J］.Clin Cancer Res，2007，13(4):1308-1314.

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［5］Herbst RS，Giaccone G，Schiller JH，et al.Gefitinib in combination with paclitaxel and carboplatin in advanced non-small-cell lung cancer:a phaseⅢ trial-INTACT 2［J］.J Clin Oncol，2004，22 (5):785-794.

［6］Mahaffey CM，Davies AM，Lara PN Jr，et al.Schedule-dependent apoptosis in K-ras mutant non-small-cell lung cancer cell lines treated with docetaxel and erlotinib:rationale for pharmacodynamic separation［J］.Clin Lung Cancer，2007，8(9):548-553.