高效毛细管电泳法同时检测饲料中七种防腐剂

曹小妹 薛江超 高文惠 闫路娜

(河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018)

饲料中加入防霉剂及防腐剂可以起到防腐、抑菌、杀菌、延长保质期等作用。防腐剂的种类繁多，常见报道的有山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸酯类。饲料中加入防腐剂有其必要性但是用量要合乎相关规定，因此探索饲料中防腐剂高效快速的检测方法尤为重要。目前毛细管电泳法检测防腐剂的报道多为碱性条件下的分离测定[1-7]，碱性不利于柱子的使用寿命；而采用酸性缓冲溶液在低pH值下，吸附和电渗流值都很小，毛细管涂层的寿命较长[8]。Mahuzier等[9]利用胶束电动色谱分别在pH值9.5和pH值2.1条件下测定MP、EP、BP、PP和对羟基苯甲酸，但是pH值9.5时对羟基苯甲酸的峰形很差。He等[10]曾报道了在pH值2.28分离测定了MP、EP、BP、PP，取得满意的分离效果。本试验旨在探索酸性条件下多种防腐剂的分离检测方法。分别从缓冲液的种类，缓冲液的浓度以及pH值几个方面选择合适的分离条件，最终获得七种物质的高效分离。

1 材料与方法

1.1 试剂

甲醇(色谱纯)、磷酸二氢钾(分析纯)、十二烷基硫酸钠(SDS)(分析纯)。

标准品：山梨酸（SA）、苯甲酸（BA）、脱氢乙酸(DHA)、对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)、对羟基苯甲酸丁酯(BP)纯度均大于99%(Sigma)。

标准溶液的配制：分别准确称取SA、BA、DHA、MP、EP、PP、BP标品 50 mg用甲醇溶解，分别定容至100 ml容量瓶。

1.2 仪器

CAPEL-105高效毛细管电泳仪，配有紫外-可见检测器(俄罗斯刘梅克斯公司生产)；LD5-2A低速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司生产)；KH5200型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司生产)；756P紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司生产）；FA2204N分析天平(上海菁海仪器有限公司生产)。

1.3 样品处理

饲料样品用甲醇：水=1：1（体积比）的混合液提取,超声25 min,然后在3000 r/min转速下离心5 min,取上清液过0.45 μm微孔滤膜后直接上机测定。

1.4 缓冲溶液的配制

用超纯水分别配制40 mmol/l KH2PO4和100 mmol/l SDS溶液，将两种溶液以体积比为1：1进行混合作为缓冲液，并调节pH值至4.00，过0.45 μm微孔滤膜备用。

1.5 色谱条件

弹性石英毛细管柱（50 cm×75 μm），检测波长为245 nm，分析电压为-18 kV，进样时间为5 s，检测温度为25℃。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

七种防腐剂的紫外光谱扫描图如图1所示。SA、BA、DHA 的最大吸收波长分别为 256、226、226 nm，MP、EP、PP、BP的最大吸收波长均为258 nm。若选定256 nm，SA、MP、EP、PP、BP 可以获得较高的灵敏度，但是BA和DHA在此处几乎没有吸收，故256 nm不可取。综合考虑七种物质的吸收情况并且获得相对较好的灵敏度，本试验选择245 nm作为检测波长。

图1 七种防腐剂的紫外吸收曲线

2.2 缓冲液的选择

本试验探究酸性条件下七种物质的分离情况，因此选择酸性的KH2PO4溶液。对羟基苯甲酸酯类是中性物质，需添加表面活性剂SDS而形成胶束电泳。

对于缓冲液浓度的选择，分别配制了40 mmol/l KH2PO4(A)和100 mmol/l SDS(B)以不同体积比的混合液，如 1：1，1：2，1：3，1：4，2：1，3：1，4：1。试验结果是：配制的A和B两种溶液体积比为1：4，1：3时，PP和BP不能完全分离(见图2中a和b)，1：2时PP和BP，MP和BA不能完全分离（见图2中c）；体积比为 2：1，3：1，4：1 时，即当缓冲液中 KH2PO4的浓度接近或大于SDS的浓度时，溶液有析出现象，不能正常使用。而当体积比为1：1，七种防腐剂可实现完全分离，故确定体积比为1：1。

图2 在KH2PO4和SDS不同体积比下七种防腐剂的色谱

pH值能影响胶束电动色谱中带电组分迁移的速度，但是不改变SDS的荷电状况，因此不影响它的泳流速度。因电渗流受pH值的限制，故它的净速度也与pH值有关[8]。在酸性条件下，分别考察了pH值为2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 六个条件下七种物质的分离情况。通过色谱图分析得到：不同的pH值影响到物质的出峰顺序，在pH=2.50～3.50条件下，MP在BA之前出峰，而在pH=4.00～5.00时BA在MP之前出峰；且从pH=2.50到pH=4.50，随着pH值的增加七种物质的出峰时间延长，但是pH=2.50～3.50时BP和PP分离不好，且pH=3.50时MP和BA也分离不好。综合考虑分离效果和出峰时间，确定4.00为试验最佳pH值。

综上所述：在最佳条件下七种物质的标准品混合溶液分离色谱图如图3所示。由图3中看出，七种防腐剂在19 min内实现了基线分离。

图3 七种防腐剂标准品的分离色谱

2.3 线性范围与检测限

配制一系列浓度（0.5～500 μg/ml）的七种防腐剂的标准溶液，在选定的最佳色谱条件下进行线性关系和检测限的测定。由表1结果可以看出，SA、BA的线性范围分别为 1～500，3～500 μg/ml，DHA、MP、PP、BP 和 PP 的线性范围均为 5～500 μg/ml。SA、BA、DHA和四种对羟基苯甲酸酯类的检测限分别为0.5、1.5、3、2.5 μg/ml。

表1 七种防腐剂的线性关系及检测限

2.4 样品的检测

饲料样品按照1.3节处理。典型饲料样品测定结果见图4和图5。由图4、图5看出,牛饲料样品中检测到BA，预混料中检测到EP和BA。

图4 牛饲料的样品

图5 预混料的样品

2.5 回收率试验

对饲料样品进行低水平和高水平的加标回收率试验，测定结果见表2。七种防腐剂的回收率为80.8%～107.0%，相对标准偏差≤5.0%。

表2 七种防腐剂的加标回收率和精密度(n=5)

3 结论

本试验建立了一种在酸性条件下同时检测饲料中酸类和酯类等七种防腐剂的快速、高效毛细管电泳方法，在19 min内实现了七种防腐剂的分离。七种防腐剂的检测限在 0.5～3 μg/ml，回收率为 80.8%～107.0%，相对标准偏差≤5.0%。本方法可以作为饲料企业自检和其他机构检测的参考方法。

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