北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

刘东明， 束长龙， 宋福平， 高继国， 张 杰

（1．东北农业大学生命科学院，哈尔滨 150030；2．中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

苏云金芽胞杆菌（Bacill us thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，在形成芽胞的同时能产生由cr y与cyt基因编码的、对多种害虫具有高毒力的杀虫晶体蛋白（insecticidal cr ystal pr otein，简称ICP）。由于其对害虫特异的杀虫活性，对人畜无害且不污染环境等优点，Bt已经成为最为有效的微生物杀虫剂，广泛应用于害虫的生物防治［1］。分离新型高效的Bt菌株与杀虫基因对进一步开发Bt杀虫剂与转基因作物有重要的意义。

Bt广泛存在于自 然界中，从 土壤［2－3］、水源［4－6］、昆虫尸体［7］、野生动物［8－11］、植物表面［12］等都可以分离出Bt。其中，土壤作为微生物生存的最佳介质，是Bt菌株最直接的来源，并且样品采集地的气候、植被也会影响到Bt菌株分布［13］。因此，从不同气候、地域特征的生态环境中采集土壤样品，有利于筛选到类型多样的Bt菌株。

苏云金芽胞杆菌休眠的芽胞在75℃的亚致死温度下处理15 min，活化效果最好［14］，依据这一特性采用温度筛选分离Bt具有分离范围广，不易漏筛等优点。获得的大量Bt野生菌株根据大质粒图谱进行分型，质粒图谱是菌株含有的质粒的琼脂糖凝胶电泳条带，与菌株含有的质粒数量、大小以及拷贝数都有关，可以作为区分不同菌株的证据［15］。采用PCR－RFLP方法鉴定Bt的杀虫基因，不但具有快速、简便的优点，而且既可鉴定出已知的基因又可检测出未知的新基因，因此PCR－RFLP鉴定体系获得了广泛的应用［16－18］。

北京植物园位于北京西山风景区，占地400 h m2，收集展示各类植物10 000余种（含品种）150余万株，在园内形成以植物类型划分数十种小园区，形成了特殊的小型生态环境。本文从北京植物园不同园区收集了149份土壤样本，进一步通过Bt菌株的分离、基因型鉴定以及杀虫活性测定等工作，研究了这种特殊的小型生态环境中Bt菌株的多样性与杀虫活性。

1 材料与方法

1．1 土样采集与菌株分离

从北京植物园的不同园区距表层5～10 c m之间的土层采集土壤样品，采用温度法［14］筛选Bt菌株，镜检观察后画线培养、分离保存。Bt标准菌株库斯塔克亚种（B．thuringiensis subsp．kurstaki）HD－1基因类型为cr y1Ac、cr y2Aa、cr y2Ab，库斯塔克亚种HD－73基因类型cry1 Ac，2株菌株均由实验室保存。

1．2 苏云金芽胞杆菌晶体类型观察

显微镜样品制备：将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色3 min，清水冲洗，100×油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方法参见文献［19］。

扫描电镜样品制备：将Bt菌株在1／2 LB平板上画线培养，30℃培养36 h，产生晶体。刮菌，灭菌水洗3次，12 000 r／min，10 min离心收集芽胞和晶体。用1 mL灭菌水悬浮。将菌液均匀涂于1 c m2薄玻璃片上，晾干。离子溅射喷金（2 n m），扫描电镜观察。

1．3 苏云金芽胞杆菌质粒图谱制备

提取Bt分离株的质粒DNA，质粒DNA提取方法、电泳方法参见文献［20］。

1．4 苏云金芽胞杆菌基因型的鉴定

采用PCR－RFLP的方法对cr y基因型进行鉴定。其中cr y1 基因鉴定方法参照文献［21－22］；cr y2、cr y3、cr y4／cr y10 基因 鉴定方法参见文 献［23］；cr y5～9基因鉴定方法参见文献［24］；cry11～cr y40基因鉴定引物参见文献［25］。

1．5 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的分析

SDS－PAGE分析方法参见文献［26］。

1．6 室内杀虫活性测定

1．6．1 大猿叶甲

将菌株样品培养，镜检发现产生晶体后，取Bt原培养液10 mL离心去上清，用10 mL灭菌水重悬，另取10 mL灭菌水作为对照，样品均匀涂布在新鲜的油菜叶上，晾干，放入生测瓶中，每瓶接初孵幼虫20头，每个处理重复3次，25℃生化培养箱中保温，培养48 h后调查死、活虫数，并观察幼虫取食情况，计算校正死亡率。试虫的选取参见文献［27］。

1．6．2 小菜蛾

菌株样品培养与处理同1．6．1，另取10 mL灭菌水作为对照，样品均匀涂布在新鲜的甘蓝菜叶上，晾干，放入生测瓶中，每瓶接2～3龄幼虫20头，每个处理重复3次，25℃生化培养箱中保温，培养48 h后调查死、活虫数，并观察幼虫取食情况，计算校正死亡率。

2 结果与分析

2．1 菌株分离与晶体形态

利用温度筛选法，共筛选出542株芽胞杆菌，进一步染色镜检显示，其中147株含有晶体，为Bt菌株，各园区土样分离菌株信息见图1。这些菌株含有的晶体类型包括大菱形、小菱形、球形、方形和不规则形等。进一步挑选代表性菌株进行扫描电镜拍照观察，结果见图2。

2．2 苏云金芽胞杆菌质粒图谱分析

通过分析北京植物园中所分离出的147株Bt菌株的质粒图谱，对其结果进行比对，把带型相同的菌株进行归类，最后得到12种类型的Bt菌株（图3），将其代表菌株命名为Z WY－1～Z WY－12。12株分离株与2株标准菌株的质粒图谱比对，发现北京植物园筛选的Bt菌株带型丰富多样。

图3 Bt菌株质粒图谱分析

2．3 Bt菌株的cry基因型鉴定

采用PCR－RFLP方法，对12株Bt进行了cry基因的鉴定，结果见表2。结果表明：有6种类型的Bt菌株鉴定出了已知基因类型，而其他6种不含有已知基因型；鉴定出的基因型有cr y1Aa、cr y1Ab、cr y1Ac、cry1Ah、cry1Ba、cr y1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab、cr y7Aa；没有检测出cr y3～cr y6、cr y8～cr y40等基因。

2．4 杀虫晶体蛋白的SDS－PAGE分析

通过SDS－PAGE分析了12株Bt所表达的Cry蛋白分子量，结果见图4，列于表2。其中Z WY－5表达约70 ku的蛋白，Z WY－11、12表达约150 ku的蛋白，其余都表达约130 ku的蛋白，ZWY－1、3、8还表达了60 ku的蛋白。

图4 分离菌株杀虫晶体蛋白SDS－PAGE电泳分析

2．5 小菜蛾、大猿叶甲的生物活性测定

小菜蛾和大猿叶甲的测定结果见表2，其中Z WY－1、3、4、6、8、9对鳞翅目菜蛾科小菜蛾的校正死亡率达到了100%，ZWY－4、7对鞘翅目叶甲科大猿叶甲有较好活性。

表2 分离菌株cr y基因型鉴定及杀虫生测结果1）

3 讨论

近几年来，国内很多学者从我国不同地域的土壤中分离到高毒力的Bt菌株，如束长龙等人在北京、海南、福建、甘肃等地的土壤样品中分离到对小地老虎有高活力的菌株［28］；胡晓婷等人在河北、山东等地的土壤样品中分离到对铜绿丽金龟幼虫有活性的Bt菌株［29］；张灵玲等人在武夷山自然保护区的土壤样品中分离到对白纹伊蚊有很高活性的Bt菌株［30］。

北京植物园具有多种高度人工化的小型生态环境，在这种环境下分析Bt菌株的多样性与分布特点的研究工作尚属首次。本文从北京植物园分离得到147株Bt菌株，分离率很高，进一步的质粒图谱分析显示这些菌株属于12种不同的类型，并且其表达蛋白、基因类型以及晶体形态都有较好的多样性。值得注意的是，菌株类型在植物园的各园区分布上有较强的园区特异性：宿根园、芍药园、月季园、碉楼中有多种类型Bt菌株分布；而Z WY－9只在栈道入口有分布，Z WY－10只在卧佛山庄中分布。这种现象可能与植被类型及人类活动有关：宿根园、芍药园和月季园的植物花朵艳丽、气味芬芳，有利于吸引昆虫，而碉楼处于植物园较偏僻的区域，附近缺乏观赏性强的植物种类，人为的活动较少，适合昆虫栖息繁殖，因而这几个区域昆虫种类、数量较多，有利于Bt菌株的扩繁，进而有较好的多样性。由此可见，为了分离到多样性较好Bt菌株，采集样品时，不仅要考虑生态环境、人为活动的影响，植被类型的多样性也是非常重要的决定因素。

本研究中检测到的基因类型有cry1Aa、cr y1Ab、cr y1 Ac、cr y1 Ah、cr y1 Ba、cr y1Be、cr y1Ia、cr y1La、cr y2Ab与cr y7Aa等，SDS－PAGE结果显示含有上述基因类型的菌株有60 ku与130 ku的蛋白条带，其中130 ku的蛋白条带属于cr y1A、cr y1B、cr y1L 以及cr y7等基因的编码产物，60 ku属于cry2类基因的编码产物，但是没有检测到81 ku的cr y1I类基因编码的蛋白，说明这些菌株中的cr y1I类基因与其他已报道的基因相同，是沉默基因［20］。

在鉴定过程中有6种类型的Bt菌株没有检测到常见的cr y基因型，而扫描电镜检测可以确定其产生规则的晶体，SDS－PAGE分析其大量表达70、130、150 ku的蛋白，说明这些菌株含有的基因类型与目前常见的高毒基因不同。而其中的Bt菌株Z WY－7和Z WY－9分别对鞘翅目大猿叶甲和鳞翅目小菜蛾具有较好的杀虫活性，说明这两株菌株中可能含有新型高效的杀虫基因。目前这两株菌正在进行全基因组测序，这对分离新型高效的杀虫基因有重要的意义。

本研究通过对北京植物园各园区分离的菌株进行分型、基因鉴定、杀虫蛋白类型分析、活性分析，不仅得到新型高效的Bt菌株，还系统地分析了菌株分布与园区植被类型的关系。研究成果不仅为新型杀虫基因的发掘提供了优质材料，而且为进一步的样品采集提供了参考依据。

［1］ Schnef E，Crick more N，Van Rie J，et al．Bacill us thuringiensis and its pesticidal cr ystal proteins［J］．J Micr obiol Mol Biol Rev，1998，62：775－806．

［2］ Anwar H M，Ahmed S，Hoque S．Abundance and distribution of Bacill us thuringiensis in the agricult ural soil of Bangladesh［J］．J Invertebr Pat hol，1997，70：221－225．

［3］ Ohba M，Shisa N，Thait hanun S，et al．A unique feat ure of Bacill us thuringiensis H－serotype flora in soils of a volcanic island of Japan［J］．J Gen Appl Micr obiol，2002，48（4）：233－235．

［4］ Ichi matsu T，Mizuki E，Nishi mura K，et al．Occurrence of Bacill us thuringiensis in fresh waters of Japan［J］．Curr Micr obiol，2000，40（4）：217－220．

［5］ 赵银娟，魏炜，李荣鹏，等．一株海洋来源的高活性Bt菌的生物学特性研究［J］．微生物学杂志，2008，28（4）：43－46．

［6］ 吴丽云，何金清，周勇，等．污水、污泥中苏云金杆菌的分离及其基因型鉴定［J］．福建农林大学学报，2010，39（1）：19－24．

［7］ Knowles B H，Farndale R W．Activation of insect cell adenylate cyclase by Bacill us thuringiensis delta－endotoxins and melittin．Toxicity is independentof cyclic A MP［J］．Bioche m J，1988，253（1）：235－241．

［8］ Swiecicka I，Fiedoruk K，Bednarz G．The occurrence and properties of Bacill us thuringiensis isolated from free－living ani mals［J］．Lett Appl Microbiol，2002，34（3）：194－198．

［9］ Lee D H，Cha I H，Woo D S，et al．Microbial ecology of Bacill us thuringiensis：fecal populations recovered from wildlife in Korea［J］．Can J Micr obiol，2003，49（7）：465－471．

［10］Lee D H，Shisa N，Wasano N，et al．Characterization of flagellar antigens and insecticidal activities of Bacill us thuringiensis populations in ani mal feces［J］．Curr Microbiol，2003，46（4）：287－290．

［11］Ohba M，Lee D H．Bacill us thuringiensis associated with faeces of the Kerama－jika，Cer vus nip pon ker a mae，a wild deer indigenous to the Ryukyus，Japan［J］．Jour nal of Basic Micr obiology，2003，43（2）：158－162．

［12］Zhang L L，Lin J，Luo L，et al．A novel Bacill us thuringiensis strain LLB6 isolated from br yophytes，and its new cr y2Actype gene［J］．Letters in Applied Microbiology，2007，44（3）：301－307．

［13］Wang J，Boets A，Van R J，et al．Characterization of cr y1，cr y2，and cr y9 genes in Bacill us thuringiensis isolates from China［J］．J Invertebr Pat hol，2003，82（1）：63－71．

［14］喻子牛．苏云金芽胞杆菌［M］．北京：科学出版社，1990：305－323．

［15］Artur o R，Jorge E．Plas mid patter ns of Bacill us thuringiensis type strains［J］．Appl Environ Microbiol，2008，74（1）：125－129．

［16］宋萍，郭丽伟，苏俊平，等．含cr y7类基因的苏云金芽胞杆菌菌株的分析［J］．华北农学报，2010，25（4）：40－43．

［17］Su X，Shu C，Zhang J，et al．Identification and distribution of Bacill us thuringiensis isolates from primeval forests in Yunnan and Hainan Provinces and northeast region of China［J］．Agricultural Sciences in China，2007，6（11）：1343－1351．

［18］初立良，郑桂玲，周洪旭，等．两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定［J］．华北农学报，2010，25（3）：235－238．

［19］Breed E G，Murray D，Smit h N R．Berger’s Manual of Determinative Bacteriology［M］．9t h ed．Balti more（USA）：The Willia ms and Wil kins Cor，1994．

［20］刘晶晶，束长龙，张杰，等．苏云金芽胞杆菌内生质粒提取方法的改进［J］．生物技术通报，2008（6）：120－123．

［21］Kuo W，Chak K．Identification of novel cr y－type genes from Bacill us thuringiensis strains on the basis of restriction fragment lengt h poly mor phis m of the PCR－a mplified DNA［J］．Appl Environ Microbiol，1996，62（4）：1369－1377．

［22］Song F，Zhang J，Gu A，et al．Identification of cry1I－type genes from Bacill us thuringiensis strains and characterization of a novel cry1I－type gene［J］．Appl Environ Micr obiol，2003，69：5207－5211．

［23］宋福平，张杰，陈中义，等．苏云金芽胞杆菌cr y基因PCRRFLP鉴定体系的建立［J］．中国农业科学，1998，31（3）：8－13．

［24］Yu H，Zhang J，Huang D，et al．Characterization of Bacill us thuringiensis strain Bt185 toxic to the Asian cockchafer：Holotrichia par allel a［J］．Curr Microbiol，2006，53（1）：13－17．

［25］苏旭东．苏云金芽胞杆菌菌株的分离和cr y基因的鉴定［D］．保定：河北农业大学生命科学学院，2005．

［26］萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯 T．分子克隆指南［M］．第2版．金东雁等，译．北京：科学出版社，1992．

［27］薛芳森，李爱青，朱杏芬，等．大猿叶虫生活史的研究［J］．昆虫学报，2002，45（4）：494－498．

［28］束长龙，谷少华，窦黎明，等．对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽胞杆菌菌株的分离与鉴定［J］．植物保护，2007，33（5）：41－44．

［29］胡晓婷，宋健，王容燕，等．对铜绿丽金龟幼虫有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的分离及鉴定［J］．华北农学报，2008，23（6）：81－83．

［30］张灵玲，关怡，黄勤清，等．武夷山土壤中分离的Bt杀蚊新菌株［J］．寄生虫与医学昆虫学报，2008，15（2）：82－85．