豇豆重花叶病毒RT－LAMP检测方法的建立

郭木金， 廖富荣， 陈 青， 林石明＊， 陈红运， 沈建国

（1．厦门出入境检验检疫局，厦门 361026； 2．福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州 350002； 3．福建出入境检验检疫局，福州 350003）

豇豆重花叶病毒（Cowpea severe mosaic vir us，CPSMV）为类小 RNA 病毒目（Picor navirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花叶病毒亚科（Co movirinae）、豇豆花叶病毒属（Comovir us）成员。该病毒主要侵染大豆（Gl ycine max）、菜豆（Phaseol us vul garis）、绿豆（Vigna r adiata）、豇豆（Vigna unguicul ata）等豆科植物，造成叶片斑驳和花叶，严重时可导致整株萎缩甚至死亡［1－2］。目前，CPSMV主要分布在美洲地区，如特立尼达和多巴哥、古巴、巴西、墨西哥等国家［2］，而在我国还没有发生危害的报道。CPSMV可通过菜豆叶甲（Cer atoma trif urcata）、南美叶甲（Diabr otica speciosa）等昆虫介体传播，也可机械传播，还可通过长豇豆（Vigna sesquipedalis）、豇豆（V．unguicul ata）等种子传播，以及花粉传播［3］。由于该病毒的自然寄主在中国广泛种植，且气候条件相似，极可能随着进境的种子和昆虫在国内广泛传播，对我国豆科植物生长造成严重威胁。

环介导等温扩增（loop－mediated isother mal amplification，LAMP）是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一个具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列，具有操作简单、快速高效、高特异性、高灵敏度等优点［4］。自问世以后，已在动物疫病的诊断、动物胚胎性别鉴定、植物病毒检测和转基因食品检测等领域逐渐得到推广应用。针对CPSMV，目前已建立了生物学测定［5］、DAS－ELISA［5］，RT－PCR［3］，IC－RT real－ti me PCR［7］等方法，但还未建立LA MP检测方法。本研究根据CPSMV外壳蛋白基因序列设计特异性引物，通过条件优化，建立了CPSMV的RT－LA MP方法，为CPSMV的检测提供一种新的快速高效、特异、灵敏的检测方法。

1 材料与方法

1．1 材料

豇豆重花叶病毒（CPSMV）毒源来自美国菌种保藏中心（ATCC）（PV－273）；豇豆花叶病毒（Cowpea mosaic virus，CPMV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，Sq MV）、安第斯马铃薯斑驳病毒（Andean potato mottle vir us，Ap Mo V）阳性对照样品购自美国Agdia公司；M－MLV Reverse Transcriptase 购自 Pr omega公司；DreamTaqTMDNA Poly merase、d NTPs和RibolockTMRNase Inhibitor购自Fer ments公司；Bst DNA聚合酶大片段购自NEB公司；Tri Pure Isolation Reagent购自Roche公司；其他生化试剂均为常规分析纯试剂。

1．2 引物设计与合成

根据Gen Bank数据库中CPSMV外壳蛋白基因已知序列，利用在线引物设计软件Pri mer Explore 4．0（http：∥pri merexplorer．jp／ela mp4．0．0／index．ht ml）进行RT－LA MP引物设计与筛选，由外引物（CPSMV－F3、CPSMV－B3）和内引物（CPSMVFIP、CPSMV－BIP）组成，其序列见表1。用于普通RT－PCR扩增的引物CPSMVf和CPSMVr，根据文献合成［6］。RT－LA MP引物和普通RT－PCR引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 豇豆重花叶病毒（CPSMV）RT－LAMP检测引物

1．3 总RNA的提取

按照Tri Pure Isolation Reagent使用说明书进行病叶总RNA的提取。

1．4 RT－PCR

普通RT－PCR扩增的反应体系及条件参照文献进行［6］。反应结束后，取5．0μL的PCR产物采用2．0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1．5 CPSMV RT－LAMP反应体系的优化

1．5．1 Mg2＋浓度的筛选

分别设置0、2．0、4．0、6．0、8．0、10．0、12．0、14．0 mmol／L等8个 Mg2＋浓度梯度，进行 Mg2＋浓度优化。在65℃下反应60 min后，取5．0μL的LA MP产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1．5．2 d NTP浓度的筛选

Mg2＋浓度筛选后，分别设置0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4、1．6、1．8 mmol／L 等 10 个d NTP浓度梯度，对d NTP浓度进行筛选。反应条件同上，反应结束后各取5．0μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1．5．3 内外引物浓度比的筛选

其他条件保持不变，调整内外引物浓度比。外引物和内引物的比例分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。反应条件同上，反应结束后各取5．0μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1．6 RT－LAMP产物检测

1．6．1 沉淀反应检测

在LA MP反应体系中，生成的焦磷酸盐可与镁离子结合而生成白色副产物—焦磷酸镁沉淀。扩增反应结束后，经5 000 r／min离心5 min，直接用肉眼观察PCR管底部是否有白色沉淀。如果产生白色沉淀为阳性反应，无白色沉淀则为阴性反应。

1．6．2 染色肉眼检测

扩增反应结束后，加入1．0μL SYBR Green I染料，观察LA MP反应液是否发生颜色变化。如果产生绿色为阳性反应，橙色则为阴性反应。

1．6．3 琼脂糖凝胶电泳检测

反应结束后，取5．0μL的反应产物，于2．0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

1．7 特异性试验

利用所建立的CPSMV RT－LA MP方法，分别对BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V等同属病毒的阳性样品，以及健康的豇豆、大豆、菜豆等寄主植物的叶片样品进行检测。

1．8 灵敏性试验

将c DNA模板进行10倍系列稀释，即稀释成1．0×10－1到1．0×10－8的8个浓度，分别进行 RTLA MP和RT－PCR检测，对比两者之间的检测灵敏度。

2 结果与分析

2．1 RT－LAMP反应体系的优化结果

以豇豆重花叶病毒c DNA为模板，CPSMV－F3、CPSMV－B3、CPSMV－FIP、CPSMV－BIP为引物，分别对Mg2＋浓度、d NTP浓度、内外引物浓度比例进行优化，LA MP扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测。从Mg2＋浓度试验结果看，随着 Mg2＋浓度升高扩增的条带也越来越清晰；当 Mg2＋浓度达到8．0 mmol／L后，随着 Mg2＋浓度升高，条带亮度没有明显变化。因此，最佳的 Mg2＋浓度为8．0 mmol／L（图1a）。

d NTP浓度试验结果表明，随着d NTP浓度升高扩增的条带也越来越清晰，当浓度为0．6～1．0 mmol／L时，条带亮度没有明显区别；当浓度达到1．2 mmol／L时，随着浓度的提高，条带亮度逐渐降低；当浓度达到1．6 mmol／L时，没有反应产生。因此，最佳的d NTP浓度选择1．0 mmol／L（图1b）。

内外引物浓度试验结果表明，随着内外引物浓度比例的逐渐增加扩增的条带也越来越清晰；当外引物和内引物比例在1∶6到1∶10之间时，条带亮度没有明显改变。为节省材料，选择外引物和内引物浓度比例1∶6为最佳浓度比（图1c）。

综上所述，所建立CPSMV RT－LA MP检测方法的最佳反应体系为Bst DNA聚合酶（8 U／μL）1．0 μL，10×Bst DNA聚合酶缓冲液2．5μL，c DNA模板2．0μL，MgSO4（100 mmol／L）2．0μL，甜菜碱（betaine）（5 mol／L）4．0μL，d NTP（10．0 mmol／L）2．0μL，10．0μmol／L CPSMV－FIP和BIP各3．0μL，10μmol／L CPSMV－F3和 B3 各0．5μL，加灭菌水补充至25μL。反应条件为：65℃温浴60 min。

此外，包括空白对照在内的各泳道中，均产生小于100 bp的引物二聚体（图1）。

图1 CPSMV RT－LAMP检测反应体系优化

2．2 RT－LAMP产物检测

沉淀观察结果表明，在CPSMV阳性样品的反应管中生成白色沉淀（白色箭头所示），而在阴性对照的反应管中没有生成白色沉淀（如图2a）。向扩增产物中加入1．0μL SYBR Green I染料后，颜色反应结果表明，在CPSMV阳性样品的反应管中产生绿色，而阴性对照的反应管则仍为橙色（如图2b）。琼脂糖凝胶电泳结果表明，可以观察到CPSMV阳性样品产生典型的梯状条带，而阴性样品则没有产生梯状条带，但产生小于100 bp的引物二聚体（如图2c）。

图2 CPSMV RT－LAMP检测结果判定

2．3 RT－LAMP的灵敏性试验

将CPSMV c DNA模板进行10倍系列稀释，分别进行 RT－LA MP和 RT－PCR 检测。RT－LA MP试验结果表明，当浓度稀释到10－3倍时，条带逐渐变淡，直至10－6倍时仍有清晰的扩增条带出现；而稀释到10－7倍时，没有产生典型的梯状条带（图3a）。常规RT－PCR检测结果表明，在未稀释的模板中除了产生约350 bp的特异性条带外，还产生大于1 500 bp、约900 bp和约230 bp的3条非特异性条带；随着模板浓度的逐渐降低，特异性条带亮度也逐渐变淡，非特异性条带消失；当稀释到10－6倍时，没有任何条带出现（图3b）。以上结果表明，所建立的RT－LAMP检测方法灵敏度比常规RT－PCR检测法高10倍。

图3 RT－LAMP和RT－PCR灵敏度试验结果

2．4 RT－LAMP的特异性试验

利用所建立的CPSMV RT－LA MP方法，分别对BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V 等同属病毒，以及健康的豇豆、大豆、菜豆等寄主植物进行检测。结果表明，在同属的BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V等病毒中均未产生典型的梯状条带，CPSMV寄主豇豆、大豆、菜豆等健康植物也未产生典型的梯状条带（图4）。因此，所建立的CPSMV LA MP检测方法并不会与同属的其他病毒及其寄主植物产生交叉反应，显示出良好的特异性。

图4 RT－LAMP的特异性试验结果

3 讨论

LAMP方法自建立以来，已逐渐在植物病毒的检测中得到推广应用。目前，已建立了日本山药花叶病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）［8］、番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）［9］、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）［10］、马铃薯Y病毒（Potato vir us Y，PVY）［11］、建兰花叶病毒（Cy mbidiu m mosaic vir us，Cy MV）［12］、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic vir us，T MV）［13］、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle vir us，BPMV）［14］等多种病毒的LA MP检测方法。本研究根据豇豆重花叶病毒外壳蛋白基因序列设计特异性引物，通过条件优化，建立了CPSMV的RT－LA MP方法。

LA MP方法具有良好的灵敏度，如闻伟刚等建立的BPMV的RT－LAMP方法的检测灵敏度比RT－PCR方法高1 000倍［14］。本研究的灵敏度检测表明，所建立的RT－LA MP检测灵敏度可以比李彬等建立的常规 RT－PCR［6］灵敏度高10倍。另外，由于该技术所利用的引物需要识别靶序列上6个特异性区域，而常规的RT－PCR方法引物只识别靶序列上2个特异性区域，所以在理论上具有更高的特异性。本试验结果表明，所建立的CPSMV RT－LAMP方法并不会与同属的其他病毒、及病毒的寄主植物产生交叉反应，显示出良好的特异性。此外，RT－LA MP方法反转录和LA MP反应均可在水浴锅（或恒温孵育器）中完成，且只需要1个温度在1 h内完成，操作也相对简便。RT－LA MP的结果检测除了可以利用常规的琼脂糖凝胶电泳方法，还可以使用DNA染料染色、沉淀观察等方法进行快速检测。因此，与常规的RT－PCR方法相比，建立的CPSMV RT－LA MP方法具有更高的灵敏度、良好的特异性，操作也更为简便、快速。

［1］ Umaharan P，Haque S Q，Ariyananyagam R P．Identification of resistance to Cowpea severe mosaic vir us （Trinidad isolate）in cowpea［Vigna unguicul ata （L．）Walp．］［J］．Trop Agric（Trinidad），1997，74：324－328．

［2］ CAB Inter national．Cr op pr otection co mpendiu m （2005 edition）［DB／OL］．Wallingfor d，UK：CAB Inter national，2005．www．cabicompendiu m．org／cpc．

［3］ ICTVd B－The Universal virus database，version 4［DB／OL］．http：∥www．ncbi．nl m．nih．gov／ICTVdb／ICTVd B／index．htm．

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［6］ 李彬，吴翠萍，粟寒，等．一种豇豆重花叶病毒RT－PCR检测方法的研究［J］．植物检疫，2010，24（4）：28－32．

［7］ 李彬，粟寒，吴翠萍，等．一种豇豆重花叶病毒IC－RT real－ti me PCR检测方法的建立［J］．浙江大学学报（农业与生命科学版），2010，36（5）：491－496．

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［14］闻伟刚，杨翠云，崔俊霞，等．RT－LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究［J］．植物保护，2010，36（6）：139－141．