下调miR-126对大鼠降血压作用的实验研究

汪 剑,袁斌斌,布艾加尔·哈斯木

(南京医科大学附属南京明基医院心内科,江苏南京,210019)

原发性高血压的是一种常见病[1],其发病与遗传基因、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、血管内皮功能紊乱等有关,但确切的病因尚未知。miRNA是一种长度约为22个核苷酸的内源性非编码、单链小RNA,在动物种系发生中具有保守序列,在基因表达调控上发挥重要作用[2]。miR2 NA具有组织特异性,在所有的 miRNA中, miR126是内皮特异性的miRNA,它能促进血管生成,维持血管的完整性等[3]。有研究表明,在高血压的患者中血清炎性因子的表达明显上调[4]。同时在高血压的患者中 miR-126高表达,而在正常人群中低表达[5]。本研究拟想通过RNAi技术来下调miR126起到治疗高血压的作用。通过构建慢病毒-下调miR-126载体,转染至大鼠中,通过每周测量收缩压(SBP)、舒张(DBP)、平均动脉压(MAP)、心率(HR)等,并且测定血清NO等含量,来研究miR-126是否有治疗高血压的作用。

1 材料与方法

1.1 慢病毒载体的构建(lenti-miR-126-KD)

采用人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体。其载体有2种真核表达启动子,启动子为CMV和 U6。在 U6启动子后的AgeI和EcoRI为限制性内切酶的识别位点。NEB Buffer 1为缓冲液,所有限制酶反应在37℃下进行2 h。克隆设计的原理图:Mo-mir-126 ripe rank:> rno-miR-126 MIMAT0000832 UCGUACCGU2 GAGUAA UAAUGCG。下调设计的原理图:利用U6启动子来表达靶基因片段,如下: MS2117-1 CCGGCGCATTATTACTCACGGT ACGATTTTTTG MS2117-2 AATTCAAAAAATCGTACCGTGA GTAATAATGCG

1.2 动物和分组

根据需求应用PBS缓冲液将慢病毒载体稀释为350μL,从大鼠的尾静脉射入。24只8周龄自发性高血压雄鼠随机分成以下4组(每组6只):①高剂量组(HD):每只大鼠注射LentimiR-126-KD 1×108;②低剂量组(LD):每只大鼠注射Lenti-miR-126-KD 1×05;③空载组(Scramblemir):每只大鼠注射Lenti-Scram2 blemir 5×107;④对照组:每只大鼠仅注射PBS。

1.3 方法

1.3.1 血压、心率和体重:应用 Softron BP-98A大鼠尾中动脉非侵入性的血压仪,在大鼠清醒状态和安静环境下,测量大鼠的尾中动脉SBP, MAP,DBP和HR,每次测量均在同一时间点,每只大鼠均连续测量至少3次,取平均值。连续观察8周以获取相关资料。分别记录试验前和试验8周后的大鼠体重。

1.3.2 免疫荧光染色:取大鼠心、肝、肺、肾脏和脑组织,将各组织进行固定、沉积、速冻、切片。将切片置于显微镜载物玻璃片容器上,加50%蔗糖,盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白,以得知慢病毒载体在体内分布情况,观察各组中绿色荧光蛋白表达的区别,同时鉴别转染是否成功。

1.3.3 酶联免疫吸附(ELISA)测定:利用3%戊巴比妥钠(0.2 g/100 g)将大鼠麻醉,开胸,用注射器从心尖取5 mL血,室温下以转速3 000 r/ min离心 15 min获得血清标本。一氧化氮(NO)、白蛋白(ALB)、谷草转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(AL T)、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)及钠、钾、钙等含量用ELISA法测定。

2 结 果

2.1 lenti-miR-126-KD的构建

下调miR-126 DNA的测序结果见图1,高亮区显示与成熟 miR-126 5′CGCATTAT2 TACTCACGGTACGA3′完全互补的反义序列。这表明慢病毒载体建立成功,病毒滴度为2×1010TU/mL。

图1 lenti-miR-126-KD的DNA测序结果高光区域为miR-126的反义核苷酸序列: A.MS2117-1;B.MS2117-2

2.2 血压和心率

如表1～表4和图2所示,收缩压,舒张压和心率在试验前和试验后8周中无统计学意义(P >0.05)。无论处理或不处理,无论药物剂量的大小均无显著影响。经过处理后4周,HD组和LD组与对照组相比,心率有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。

2.3 绿色免疫荧光蛋白染色

慢病毒载体没有明显的嗜组织性。绿色荧光在每个组织中的表达,如图3。所有组织在每一组显示绿色荧光,其脑组织中分布较少,多在肺组织。

2.4 一氧化氮和生化指标

一氧化氮和生化指标如AST、AL T、ALB、CHOL、HDL-C、TG、BUN、CREA、钠、钾、钙等,各组间无统计学差异(P>0.05)。见表5。

表1 收缩压的时间依赖性(±s,mmHg)

表1 收缩压的时间依赖性(±s,mmHg)

时间 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 对照组(n=6) P value Pre-administer 167.32±8.83 166.67±7.54 162.62±9.31 164.95±9.48 0.809 1stweek 174.80±3.12 177.86±4.31 175.97±4.32 180.22±6.77 0.364 2ndweek 186.98±5.34 187.71±5.30 182.16±4.42 182.22±5.45 0.163 3rdweek 189.86±7.73 185.07±6.96 187.94±7.21 190.28±8.99 0.667 4thweek 179.83±7.06 184.62±8.93 187.75±5.65 185.44±8.20 0.469 5thweek 180.08±7.18 178.39±12.39 184.60±7.69 188.14±6.24 0.268 6thweek 187.35±12.50 192.85±8.44 186.06±10.89 189.71±12.53 0.740 7thweek 193.25±8.39 187.54±8.11 190.06±4.51 187.58±7.01 0.570 8thweek 182.88±5.33 189.17±7.12 183.65±4.29 185.50±8.03 0.405

表2 平均动脉压的时间依赖性(±s,mmHg)

表2 平均动脉压的时间依赖性(±s,mmHg)

(3Kruskal-Wallis nonparameter test)

时间 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 对照组(n=6) P Pre-administer 143.43±9.95 140.28±10.55 135.29±6.85 139.30±8.50 0.527 1stweek 145.44±9.21 144.39±6.91 144.18±9.10 147.04±8.45 0.926 2ndweek3 155.88±13.62 152.46±6.71 150.15±3.69 152.32±5.05 0.6983 3rdweek 163.25±10.85 155.92±8.50 160.70±6.22 162.52±9.73 0.520 4thweek 151.25±7.26 160.12±7.76 159.64±8.63 158.69±14.95 0.563 5thweek 153.60±5.56 161.94±8.41 155.68±7.46 164.25±12.27 0.221 6thweek 162.29±7.82 167.37±5.67 159.58±6.69 162.80±10.35 0.409 7thweek 156.58±5.30 157.74±4.58 158.00±10.34 157.04±9.84 0.992 8thweek 150.40±4.75 161.25±9.47 154.18±6.64 154.74±6.65 0.182

表3 舒张压的时间依赖性(±s,mmHg)

表3 舒张压的时间依赖性(±s,mmHg)

时间 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 对照组(n=6) P Pre-administer 131.4±10.63 127.06±12.59 121.10±13.02 127.08±13.22 0.599 1stweek 130.83±9.67 128.31±8.00 129.44±8.77 130.88±9.58 0.956 2ndweek 139.33±11.17 134.86±10.17 134.64±7.82 137.45±8.58 0.837 3rdweek 150.33±11.18 140.19±8.99 146.92±7.55 146.70±11.23 0.415 4thweek 137.75±6.93 147.73±11.11 145.83±8.40 145.48±13.95 0.539 5thweek 140.08±6.71 152.90±11.04 141.96±6.11 152.01±12.89 0.103 6thweek 150.31±9.33 153.72±7.32 146.22±12.24 149.62±13.19 0.704 7thweek 138.58±7.60 143.67±6.14 141.72±5.95 142.00±12.82 0.8293 8thweek 134.08±10.22 146.76±7.80 139.44±9.58 138.86±14.16 0.332

表4 心率的时间依赖性(±s,mmHg)

表4 心率的时间依赖性(±s,mmHg)

时间 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 对照组(n=6) P Pre-administer 425.07±56.25 399.28±30.59 412.91±30.54 425.07±56.25 0.705 1stweek 389.52±33.68 400.97±62.05 403.62±37.63 389.52±33.68 0.974 2ndweek 397.88±36.72 409.52±91.75 398.48±58.01 397.88±36.72 0.973 3rdweek 419.91±40.97 407.85±23.48 440.32±59.09 419.91±40.97 0.538 4thweek 378.84±27.79 412.23±44.57 437.79±68.45 378.84±27.79 0.105 5thweek 400.67±38.67 417.57±50.22 450.89±53.38 400.67±38.67 0.405 6thweek 419.62±45.17 422.95±41.81 457.44±86.22 419.62±45.17 0.365 7thweek 391.58±52.02 401.56±51.51 473.94±47.49 391.58±52.02 0.111 8thweek 392.62±13.94 413.52±65.57 423.39±72.69 392.62±13.94 0.178

3 讨 论

慢病毒载体是一种复制缺陷的反转录病毒载体,本研究中我们采用慢病毒作为下调miR-126的载体,其含有两个启动子,一个是CMV启动子,它促进绿色免疫荧光蛋白基因的表达。另一个是U6启动子,在它的下游插入与mir-126互补的靶基因片段 ,从而使基因下调。如图1所示 ,构建载体后成功测序。病毒载体转染八周后,在自发性高血压大鼠(SHR)心脏、肾脏、肝脏、脑及肺的组织切片检测到绿色荧光,如图4所示。这表明慢病毒转染成功,并且在试验结束时在SHR中仍有可确定的密度。原发性高血压的发病机制非常复杂,有文献推测炎症和免疫反应可能是重要的机制之一。Liu等[6]检测到miR-126可以在细胞和系统水平下调VEGF的表达,亦有研究表明,miR-126在高血压患者中高表达。因此我们拟想miR-126可能会减少内源性VEGF的表达,从而导致高血压的发生。遗憾的是,本试验并未取得预期的结果。经过8周观察,与 Scram2 blemir及对照组相比较,并未发现血压下降,NO及其他生化指标,心率等亦无统计学差异。

图2 SBP、MAP、DBP和HR分析

图3 绿色免疫荧光蛋白的表达A.脑组织;B.肝脏组织;C.肺组织; D1.心肌纵向切面;D2.心肌横向切面; E1.应用低功率透镜观察的肾脏组织; E2.应用高功率透镜观察的肾脏组织

下调miR-126的表达并未达到降压的目的。推测有四种可能:①目前对miR-126的功能研究基于体外研究,很少进行体内试验,利用慢病毒作为治疗高血压的载体基因的体内研究是非常有限的,尚未确定是否需要重复处理[7]。在本研究中,注射八周后观察到绿色荧光,本研究可以确定慢病毒载体相关浓度可以被检测到,但不能证实已达到治疗浓度,且也不能确认miR-126表达是否成功下调。应该进一步采用 Westen-blot, RT-PCR和基因芯片等技术检查SHR大鼠中miR-126的浓度,获得各组miR-126的表达差异和浓度梯度,由此来确认处理是否合理;②观察时间:慢病毒载体的基因治疗反应慢、持续时间长[8],本研究中每周观察1次,这个方法是否合理仍需进一步研究;③大鼠与人类的差异:本研究是以高血压患者与健康人之间的显著差异性为基础的,毕竟人和大鼠在基因组学、遗传学、生理学等各方面都有显著偏差,其基因表达程度,激活机制和功能都可能不一致;④miR-126表达可能仅仅是高血压的一个代偿机制。本研究推测在高血压患者中,内皮功能损伤,炎症反应被激活, miR-126表达代偿性增高,一方面它可以激活VEGF信号通路,促进内皮增生和损伤的细胞修复,抑制血管增厚,改善血管重构[9];另一方面,激活的VEGF通路可以促进eNOS产生NO,逆转肾素-血管紧张素-醛固酮系统紊乱[10]。

表5 一氧化氮和生化指标(±s)

表5 一氧化氮和生化指标(±s)

指标 HD(n=4) LD(n=5) Scramblemir(n=5) 对照组(n=5) P NO(μmol/L) 8.30±5.00 8.08±6.35 14.00±10.01 4.49±2.06 0.233 ALB(g/L) 16.02±1.74 16.62±1.45 17.15±1.72 18.62±0.57 0.131 CHOL(mmol/L) 1.74±0.32 1.59±0.06 1.69±0.12 1.64±0.05 0.552 LDL-C(mmol/L) 0.22±0.14 0.14±0.12 0.15±0.10 0.06±0.04 0.280 TG(mmol/L) 0.27±0.07 0.22±0.09 0.28±0.32 0.29±0.10 0.601 AST(U/L) 311.03±56.75 213.84±63.46 244.84±119.86 205.04±165.65 0.610 ALT(U/L) 59.37±8.66 57.67±8.96 61.47±13.63 65.32±9.18 0.764 BUN(mmol/L) 8.44±1.20 7.67±1.30 7.09±1.27 6.75±1.57 0.398 CREA(umol/L) 41.13±4.77 36.76±11.97 29.97±3.96 34.47±3.36 0.244 Na+(mmol/L) 146.27±2.21 147.93±1.32 147.37±1.46 146.36±1.86 0.422 K+(mmol/L) 6.86±1.07 6.07±0.63 6.75±0.53 6.66±0.71 0.250 Ca2+(mmol/L) 2.42±0.04 2.40±0.12 2.42±0.11 2.40±0.06 0.976

综上所述,下调miR-126在抗高血压治疗方面无显著性意义,高血压患者中miR-126水平的高表达可能是由于代偿机制[11-14]。但是,本研究有一定的局限性,需要进一步的研究来揭开其中的潜在机制。

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