微泡超声造影剂在临床治疗诊断中的应用*

王艳华

(天津市医疗器械技术审评中心，天津 300191)

超声造影剂的研究经历了三个阶段，即以CO2自由微气泡为代表的第一代无壳膜型造影剂、以Levovist(利声显)为代表的第二代含空气微气泡有壳膜型造影剂和以SonoVue为代表的第三代含惰性气体的新型微泡造影剂。微泡超声造影剂通过改变聚合条件使其声学特性可以设计，可为某种成像条件量身定做的造影剂，使粒径分布更加集中，后方声衰减微弱，延长体内外的存留时间，从而应用于不同生理和病理状态下及靶向药物的输送。微泡超声造影剂作为靶目标显像、药物载体和基因载体，推动了超声造影在临床诊断及治疗中的应用。

1 在临床诊断中的应用

宾建国［1］以廉价和生物相容性好的N－软酯酰基壳聚糖为膜材料，采用声振法制备PCMB造影剂，经大鼠尾静脉团注射0.1 ml该造影剂观察大鼠左心室、肝脏、肾脏超声造影效果，脱机分析峰值强度(PI)、达峰时间(TTP)、峰值减半时间(HPT)、廓清时间等参数，并与全氟显进行造影性能比较。结果PCMB分布均匀，浓度为(2.88 ±0.45) ×109/ml，直径为(1.31 ±0.07) μm(99.98%微泡直径小于8 μm)，表面电位为(55.03 ±3.08)mV;对大鼠左心室、肝脏、肾脏超声造影图像清晰，PI和 TTP与全氟显相近(P＞0.05)，但HPT及廓清时间明显延长(P＜0.01)，表明N－软酯酰基壳聚糖为壳膜材料制备新型超声造影剂具有良好的超声对比成像效果。

张雪华等［2］采用机械振荡法制备载卡莫司汀脂质超声造影剂，显微镜下观察并计算其浓度，马尔文测量粒径大小、分布、电位，高效液相色谱法测量药物的包封率。微泡经冷冻干燥与60Co辐照消毒后，经兔耳缘静脉注射，观察其在兔肝内显像效果。结果载药脂质造影剂的浓度为(2.6～3.1) ×109/ml，平均粒径为(1.05± 0.20)μm;卡莫司汀包封率为 42.6% ±0.11%;电位为 － (12.93 ±1.84)mV;经兔耳缘静脉注射后，兔肝内可见持续的增强显像效果。卡莫司汀脂质超声造影剂增强了显像效果，为肿瘤的靶向治疗提供可能。

采用特异性配体(包括抗体、受体蛋白等)与脂质体连接形成靶向免疫脂质体超声造影剂可能是一种很有前途的导向诊断和治疗方法。在血栓性疾病的诊断方面，由于早期新鲜血栓的回声与血液回声基本相似，因此，超声对新鲜血栓的检出率受到限制。如果能制备一种亲血栓性靶向超声造影剂，以此改善血栓的超声显影效果，有望提高超声检出新鲜血栓的准确性和敏感性。夏红梅［3］通过生物素－抗生物素蛋白桥连法，制备携带血栓靶向配体的脂膜超声造影剂，以非靶向脂膜微泡为对照，评价靶向微泡配体结合率及其影响因素。结果靶向微泡荧光检测为阳性，对照组为阴性;同时还显示该血栓靶向微泡配体结合率达82.96%，对照组仅为 0.92% 和 0.89%。表明生物素－抗生物素蛋白桥连接法可以成功制备血栓靶向脂膜超声造影剂。

李殿城［4］在研制了新型超声造影剂，使其具有良好显影效果的同时，还能够作为载体携带基。试验中采用薄膜分散法，选用体内可降解的二软脂酰卵磷脂(DPPC)和1，2－二油烯氧基 －3－三甲氨基丙烷(DOTAP)，制备超声造影剂，以声诺维超声造影剂、PBS和水合液作为对照组，比较其基因携带能力。采用体内、外显影实验，观察自制超声造影剂的显影效果和时间。结果自制超声造影剂与声诺维超声造影剂相比有较好的基因携带能力，而声诺维超声造影剂与PBS及水合液的携基因能力无明显差异。体外超声显影显示，自制超声造影剂有很好的影像增强效果和较好的基因携带能力。

靶向对比超声技术［5］是利用超声微泡表面固有的生物学特性或通过对微泡表面进行特殊处理构建成靶向超声微泡，经静脉注入后能靶向性聚集并较长时间滞留于靶组织或靶器官中，再通过对比超声(CEU)产生分子水平显影的一种新兴的超声成像技术。

有学者将血栓靶向短肽片段精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸(RGDS)连接于脂质微泡表面，成功构建稳定性良好的亲血栓靶向超声微泡［6］。而通过耦联剂将抗ICAM－1单抗连接于白蛋白微泡外壳，构建了主动性靶向动脉粥样硬化斑块的超声微泡，并证实该微泡可实现对兔腹主动脉内膜及粥样斑块的有效靶向显影，使超声诊断的敏感性显著提高［7］。

有研究证实［8］，超声联合微泡能够提高诊断肿瘤的敏感性，也可作为药物载体，降低药物的毒副作用。竹红菌素(HA)是一种脂溶性的光疗药物，临床用于治疗多种疾病，包括皮肤病和肿瘤等，还可抑制细菌增长，并对人体免疫缺陷病毒(HIV)有光致死作用等，有可能成为新一代抗癌药物，但HA存在一定的光毒性。

刘学兵等［9］采用机械振荡的方法制备载竹红菌素脂质超声微泡，并测定其粒径大小、分布、Zeta电位和包封率、稳定性及超声辐照后药物释放情况，采用不同超声模式观察微泡在兔VXZ肝肿瘤的显像效果及过程。结果表明超声辐照能够促使微泡释放药物，对兔VXZ肝肿瘤的显影效果好，符合理想的药物载体，为实时监控下的体内定位光动力治疗疾病提供了一种新的思路。

2 药物载体和基因转染的作用

脂质微泡作为药物、基因载体的研究目前已经取得了较大的进步。超声辐照使微泡破裂产生的空化效应能够增加血管壁的通透性及靶向释放药物，从而使更多的药物到达靶组织，超声联合微泡能够使细胞吸收药物增加［10］。

紫杉醇对人肝癌HepG2细胞生长有明显的抑制作用，其作用机制主要表现在DNA合成期及G2/M期阻滞和一定数量的细胞凋亡［11］。刘瑶等［12］将紫杉醇包裹入微泡，制作成载紫杉醇超声微泡造影剂，以人肝癌HepG2细胞株为材料，研究载紫杉醇超声微泡造影剂抑制HepG2细胞生长和诱导其凋亡的作用。结果载紫杉醇微泡造影剂在一定能量超声辐照下释放药物进入细胞，其对肝癌HepG2细胞有较好的增殖抑制作用，并能够诱导肝癌HepG2细胞产生凋亡。

载多烯紫杉醇脂质微泡(DLLM)物理性质较好，超声辐照能够促使微泡包裹的药物释放［13］。杨健［14］在实验中应用DLLM联合超声靶向微泡破裂技术(UTMD)对人胰腺癌细胞株BxPC3的增殖抑制和凋亡诱导作用，实验表明DLLM联合UTMD能够增加G2/M期细胞阻滞，明显抑制人胰腺癌BxPC3细胞增殖并促进细胞凋亡诱导作用，在等量药物剂量下达到药物有效浓度更高，有利于减少化疗药物的毒副作用，有望成为一种用于胰腺癌综合治疗的新型药物载体，为探讨DLLM联合UTMD在胰腺癌治疗方面的应用价值提供实验依据。

伍星［15］首次通过活体研究，证实超声定位辐照载药微泡的方法能有效介导药物集中释放到肿瘤组织，明显抑制肿瘤生长。试验中为观察超声定位辐照载紫杉醇脂质微泡(PLM)介导药物释放的方法对裸鼠人卵巢癌移植瘤的抑制效应，对荷瘤鼠进行分组处理，包括超声定位辐照PLM组、单纯静脉给药组、超声定位辐照脂质微泡组、单纯静脉输注PLM组和生理盐水对照组，结果各组的肿瘤体积、抑瘤率及血管内皮生长因子(VEGF)表达均有差异(P＜0.01)。超声定位辐照PLM组的肿瘤体积与质量最小，抑瘤率最大，VEGF表达量最低。表明超声定位辐照PLM的方法能有效介导药物释放，具有较强的体内抑瘤效果，有望成为新的肿瘤化疗给药方式。

近年利用超声微泡造影剂增强显像的同时，还发现其具有介导目的基因转移的作用［16］。大量实验［17］证实，在适当剂量超声辐照下，超声微泡介导基因转移与传统单纯载体携带基因转移相比，目的基因转移、表达效率大大提高。

视网膜母细胞瘤(RB)是婴幼儿常见的眼内恶性肿瘤。目前国内治疗普遍采用的眼球摘除术，及放疗和化疗等，均可引发诸多不良后果［18］。超声微泡造影剂作为一种新型的基因转移载体，可达到基因高效、定向的转染目的。周希瑗［19］为探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下，介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤(RB)细胞的效率及可行性。将RB细胞分为6组，1组以一定能量的超声波辐照，2组加适当剂量的微泡造影剂，3组加入质粒，4组加入质粒与微泡，5组加入质粒、微泡，并用一定能量的超声辐照，6组予脂质体与质粒。转染24～48 h后观察EGFP表达，并用RT－PCR进行检测。同时对1、2组予以染色。结果超声微泡介导的DNA质粒对RB细胞的转染效率，与脂质体介导的质粒转染效率相似，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照及适当浓度的微泡，对RB细胞的活性无明显抑制。表明利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。

张萍［20］为观察超声联合微泡对血管平滑肌细胞(VSMCs)周期分布及细胞周期调节蛋白激酶(CDK2)和抑制物p27表达的影响，探讨超声联合微泡抑制VSMCs增殖的作用机制，采用体外培养的VSMCs经血小板衍生生长因子－BB(PDGF－BB)刺激后，以低频连续波超声(频率1 MHz、声强为0.3 W/cm2)联合脂质微泡(1μl/ml)辐照VSMCs 60 s。分别用流式细胞仪、免疫细胞化学法检测细胞周期分布和细胞周期调控蛋白 CDK2、p27的表达。结果 与对照组比较，PDGF－BB刺激组细胞G0～G1期细胞比例下降而S期细胞比例增高(P＜0.01)，CDK2表达上调而p27表达降低(P＜0.01);与PDGF－BB组相比，超声联合微泡组G0～G1期细胞比例增高 (P＜0.01)，CDK2表达下调而p27表达增高(P＜0.01)。结论:超声联合微泡下调CDK2蛋白和上调p27蛋白的表达，阻滞细胞周期进程，可能是抑制VSMCs增殖的机制之一。

微泡超声造影剂的研制成功并应用于临床，使超声造影声像图质量得到极大改善，分辨率明显提高，同时大大减少了伪像，并且能够实时显示血流灌注情况，提高了超声造影的临床诊断水平。

伴随着超声造影技术和微泡超声造影剂的不断发展，超声造影剂可以携带基因及药物进入体内，然后在超声空化作用下释放基因及药物进入细胞内，从而达到一定的治疗作用，并在未来临床治疗中显示出巨大潜力。

1 宾建国，吴爵非，黄瑞珠，等.以N－软酯酰基壳聚糖为壳膜的新型超声微泡造影剂的对比成像.中国医学影像技术，2010，26(7):1197

2 张雪华，李映良，全学模，等.载卡莫司汀脂质超声造影剂制备及特性的研究.重庆医科大学学报，2009，34(11):1538

3 夏红梅，高云华，刘政，等.血栓靶向脂膜超声造影剂的制备与初步评价.中国医学影像技术，2008，24(2):2176

4 李殿城，朱家安，郭微，等.可携基因超声造影剂的制备及其体内外显影效果.上海交通大学学报(医学版)，2010，30(9):1024

5 Dayton P A，Ferrara K W.Targeted imaging using ultrasound.JMagn Reson imaging，2002，16(4):362

6 杨钰楠，高云华，谭开彬，等.携RGDS超声造影剂的制备及体外靶向血栓研究.第三军医大学学报，2006，28(6):562

7 李馨，高云华，谭开彬，等.携CD54单抗的靶向超声造影剂增强兔腹主动脉内膜及粥样斑块显影的实验研究.中华超声影像学杂志，2005，14(3):229

8 Sehnelde M.Molecular imaging and ultraound－assisted drug delivery.J Endourol，2008，22(4):95

9 刘学兵，王志刚，许川山，等.载竹红菌素脂质微泡的制备及对兔VXZ肝肿瘤的显影实验.中国医学影像技术，2008，24(10):1508

10 TartlSM S，MeCallan J、Lum A F，et al.Therapeutic effeets of paellraxel－ contalnzngultrasoundeontrastagents.Ultrasound Med Biol，2006，32(11):1771

11 何松，沈薇，沈鼎明.体外观察紫杉醇对肝癌HepG2细胞生长的影响.重庆医学，2003，32(3):268

12 刘瑶，康娟，吴小翎，等.载紫杉醇超声微泡造影剂对人肝癌细胞株HepG2增殖影响及诱导凋亡作用研究.中国超声医学杂志，2008，24(8):676

13 Kang J，Wu X，Wang Z，et al.Antitumor effect of docetaxel－ loaded lipid microbubbles combined with ultrasound－targeted microbubble activation on VX2 rabbit liver tumors.JUltrasound Med，2010，29(1):61

14 杨健，康娟，曾妍，等.载多烯紫杉醇脂质微泡增强人胰腺癌BxPC3细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用.南方医科大学学报，2012，32(5):618

15 伍星，王志刚，张勇，等.超声定位辐照载药微泡治疗卵巢癌移植瘤的实验研究.中国超声医学杂志，2007，23(3):179

16 江珍珍，夏国园，熊中奎，等.超声微泡介导基因转移在治疗纤维化病变中的应用.中国医学影像技术，2010，26(5):983

17 孙龙，官泳松，周翔平，等.介入放射学在肿瘤基因治疗中的意义.中国介入影像与治疗学，2004，1(2):151

18 李涛，张虹，王骞，等.HSV－tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应.华中科技大学学报(医学版)，2003，10:533

19 周希瑗，邓鑫，王志刚.超声微泡介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤细胞与传统转染方法效率对比.中国超声医学杂志，2006，22(8):564

20 张萍，高云华，刘平，等.超声联合微泡抑制血管平滑肌细胞增殖机制的研究.临床超声医学杂志，2008，10(12):793