脑源性神经营养因子与氨基糖苷类抗生素耳中毒

林垦 综述 马静 张铁松 阮标 审校

脑源性神经营养因子（brain－derived neuotrophic factor，BDNF）是1982 年德国神经生物学家Barde等从猪脑中分离出来的小分子蛋白质，是神经营养因子家族中的成员之一，该家族的其他成员还有NGF、NT3和NT4／5［1］。研究显示，BDNF 对离体和在体听神经受损伤神经元有存活和再生作用［2，3］，BDNF和NT3对来源于神经嵴和基板的感觉神经元残存细胞有促进保护作用［4］。氨基糖苷类抗生素在临床上被广泛用于控制革兰氏阴性和阳性菌感染，但此类抗生素具有严重的耳毒性副作用，可使患者发生不可逆转的听力损失。已有研究证实BDNF是听觉和前庭神经元发育过程中生存的关键营养因子，对成年豚鼠氨基糖苷类抗生素致聋有明显的保护作用［5］。利用基因治疗的途径是目前感音神经性聋基础研究领域中的重点课题。本文就脑源性神经营养因子与氨基糖苷类抗生素耳中毒方面的研究作一简要综述。

1 氨基糖苷类药物耳毒性及其机制

1.1 氨基糖苷类抗生素在内耳的蓄积 与其他组织相比较，耳蜗中存在由微血管内皮细胞为主构成的血－ 迷路屏障结构，该屏障限制了氨基糖苷类抗生素通过的速度，致使内耳外淋巴液中药物浓度上升及药物消除缓慢［6］。氨基糖苷类抗生素在外淋巴液中的半衰期远长于血液中的半衰期，这就造成了药物在内耳淋巴液中的聚集，从而对前庭和耳蜗毛细胞产生毒性作用。不同部位的毛细胞摄取氨基糖苷类抗生素的顺序不同，氨基糖苷类抗生素可长时间地停留在毛细胞内，构成氨基糖苷类抗生素损伤耳蜗听觉功能和慢性损害的重要基础［7］。

1.2 氨基糖苷类抗生素对内耳毛细胞的损伤 氨基糖苷类抗生素基本上被耳蜗内所有类型的细胞摄取，包括未被药物损伤的细胞，除毛细胞外，还有基底膜下的间质细胞、Ⅲ型成纤维细胞都对氨基糖苷类抗生素都有高亲和力，并在摄取后使药物长时间潴留［8］。细胞的死亡可分为坏死和凋亡两大类［9］。氨基糖苷类抗生素通过损伤毛细胞线粒体和溶酶体两个途径致毛细胞坏死［7］。氨基糖苷类抗生素在进入毛细胞后触发了活性氧及JNK 酶的活性，导致了毛细胞线粒体内的细胞色素C 的释放，激活了凋亡及核酸，并出现核固缩，最终出现毛细胞的坏死或凋亡［10］。陆文铨等［11］对豚鼠研究表明，耳蜗柯替器毛细胞凋亡与氨基糖苷类抗生素耳毒性的产生具有紧密的关系；同样，柱细胞、Deiters以及螺旋神经节细胞和血管纹细胞也有存在凋亡现象。

1.3 氨基糖苷类抗生素对螺旋神经节神经元的损伤 组织学研究表明，氨基糖苷类抗生素可致动物耳蜗神经肿胀、脱髓鞘、树突退行性变，同时观察螺旋神经节细胞内神经微丝变化，核周体退变，线粒体层状小体形成，甚至螺旋神经节细胞变性死亡［12］。王大君等［13］观察硫酸庆大霉素对体外培养的小鼠的耳蜗神经节细胞生存数和细胞突起长度的影响，结果显示硫酸庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的生存个数无明显影响，提示氨基糖苷类抗生素对螺旋神经节细胞的影响可能是继发性的。

邓嘉虹等［14］观察到庆大霉素对小鼠螺旋神经节神经元电生理特性的影响，结果显示庆大霉素通过抑制螺旋神经节神经元细胞的钾离子通道而产生耳毒性。此外，许多学者根据氨基糖苷类抗生素诱导的自由基损伤学说，在应用氨基糖苷类抗生素时，应用抗氧化剂或自由基清除剂，甚至基因治疗来预防氨基糖苷类抗生素耳毒性的报告已有不少，但很少符合实际的临床应用［15］。李明栋等［16］观察到庆大霉素作用下豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡相关蛋白bcl22 和Bax 的表达发生了显著的变化，表明bcl22和Bax与庆大霉素诱导的螺旋神经节细胞凋亡密切相关，bcl22家族参与了庆大霉素诱导的耳蜗细胞凋亡。上述研究说明氨基糖苷类抗生素造成螺旋神经节细胞损伤的作用机制还无明确一致的结果，尚有待进一步研究证实。

2 BDNF对耳蜗的保护作用

BDNF通过抑制活性氧产物可达到对庆大霉素损伤的毛细胞的保护作用，与D－蛋氨酸、NG－硝基－L精氨酸甲酯（NG－nitro－L－arginie methy l ester，L－NAME）联合使用其保护作用更强［17］。李鹏等［18］研究表明，转染内耳的BDNF可保护外毛细胞，抑制顺铂对耳蜗听功能的损害［18］。郑国玺等［19］报道BDNF能减少毛细胞的死亡，对新生大鼠耳蜗毛细胞具有保护作用。目前就BDNF 对毛细胞的保护作用机制报道不多，但以上实验表明神经营养因子确实可减少氨基糖苷类抗生素对毛细胞的损害，其机制还需进一步实验予以证实。

活体实验证实，BDNF 和NT3 mRNA 在平衡听觉的神经移植中可以诱导神经轴突的生长［4］。相关实验研究报道，BDNF 持续灌注豚鼠耳蜗后可对氨基糖苷类耳毒性药物致聋后的螺旋神经节细胞胞体及树突起保护作用，并且电听觉反应的敏感性随之相应提高［20］。Shinohara等［21］利用电极植入注有神经营养因子（BDNF和睫状神经营养因子）的耳聋豚鼠耳蜗，发现神经营因子不仅提高了螺旋神经节细胞的成活率，更重要的是提高了听觉系统对电刺激的反应性。这些结果都显示，BDNF 和NT3（不包含NT5和NGF）是耳蜗和前庭神经元中最初营养保护因子。陈谦等［22］利用噪声制备豚鼠耳聋模型，在噪声损伤7d 后，通过圆窗膜注入以腺病毒为载体的重组Ad－BDNF，4周后，取耳蜗组织固定切片，进行BDNF 抗体免疫细胞化学染色和HE 染色，结果发现腺病毒介导的BDNF 基因可长期表达于内耳中，并且可在噪声引起毛细胞死亡后有效地抑制听神经元的退行性变。张青松等［23］研究豚鼠耳蜗在顺铂干预后螺旋神经节BDNF和NGF出现高表达，提示BDNF 和NGF 对顺铂诱导的螺旋神经元损伤有保护作用。朱纲华等［24］观察脑源性神经营养因子基因修饰骨髓基质细胞对体外培养小鼠螺旋神经元的影响，结果显示在体外BDNF 基因工程细胞能促进螺旋神经元的生长，并保护螺旋神经元免受氧化损伤。翟所强等［25］用腺病毒携带的神经营养因子注入噪声损伤的耳蜗发现，BDNF 可有效地阻止和延缓螺旋神经元的退变。BDNF基因主要表达在耳蜗底回，这与它的受体表达部位是一致的，而NT3则与BDNF表达部位相反，正是这两种神经营养因子的联合作用在出生后的螺旋神经节细胞中起重要作用［26］。也有学者认为胚胎期的BD－NF主要表达在蜗尖，NT3表达在耳蜗底回，BDNF对中部和蜗尖的残存的螺旋神经节细胞有支持作用［27］。同时，研究证明在螺旋神经节细胞成活和诱导周围神经生长方面，几种不同的神经营养因子联合作用比单独一种因子的作用要显著［21］。听泡中的BDNF和NT3mRNA 在诱导平衡神经节轴突向内生长的过程中及开始前的表达，都证明了NT3或者BDNF或者是两者同时应用都可以用作早期神经纤维的生长诱导。其他结果也同样证明这些神经营养因子在耳蜗和前庭神经元的以后研究中占据重要地位［4］。

3 BDNF对耳蜗的保护作用的可能机制

3.1 BDNF 和酪氨酸激酶B（tryosine kinase B，TrKB）在听神经系统中的表达 发育成熟的人的BDNF序列与猪、鼠的BDNF 完全相同，而且与发育成熟的人的NGF、NT3和NT4／5约有50%的同源性［28，29］。BDNF和NT3及其受体对外毛细胞的分布起很重要作用［30］。在感觉上皮内，NT3和BDNFmRNA 在听泡的特定区域有强表达，体外实验证实BDNF在听觉神经元中有强表达，NT3也有中等强度表达，在内耳的表皮细胞中含有这些神经营养因子的转录产物，听觉神经元中有高水平的TrKB，中等水平的酪氨酸激酶C（TrKC）。在内耳的感觉上皮中缺乏明确的酪氨酸激酶S（TrKS）表达的方法，但其亚群在听觉平衡系统中表达酪氨酸激酶A（TrKA）（约15%）、TrKB（约65%）和TrKC（约45%），它们协同组成部分神经营养素酪氨酸激酶（TrK）系统，但它们的具体作用仍然有待研究［31］。TrKB是癌基因TrK 编码的BDNF 酪氨酸蛋白激酶受体，基因敲除动物实验证实，BDNF 和TrKB基因敲除的小鼠约80%的耳蜗前庭神经元和Ⅱ型螺旋神经节细胞缺失［32］。进一步研究发现，NT3的转录产物出现在听觉器官和前庭的不同感觉上皮细胞和支持细胞中，在这些感觉上皮细胞中，NT3的表达强度呈级度递加，但是BDNF的表达限制在听觉器官、前庭器官的感觉上皮细胞及壶蝮脊细胞中［4］。啮齿类动物中，TrKB 基因能产生若干不同的转录物，其中有两种mRNA 编码全长或催化形式的TrKB，是介导BDNF 主要生物学活性的受体［33］。TrKB可以被BDNF和NT3激活，TrKC 产物有NT3的作用受体［4］。BDNF 与TrKB 高度特异性结合后可以快速产生自动磷酸化过程，而启动细胞的转录实现其作用机制。

3.2 BDNF 对耳蜗的保护途径 推测BDNF 对毛细胞的保护作用机制是抑制由庆大霉素及顺铂耳毒性产生的活性氧。BDNF与钙蛋白酶抑制剂联合使用对庆大霉素损害毛细胞的保护无增强辅助效应，因钙蛋白酶抑制剂是抑制氨基糖苷类抗生素致毛细胞凋亡的作用，据此推测BDNF 可能不参与抑制毛细胞的凋亡［17］。

BDNF的神经营养作用非常广泛，对外周和中枢的多种神经元具有营养作用，能够维持多类神经元包括感觉神经元、运动神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、γ氨基丁酸（GABA）能神经元、小脑颗粒神经元等的存活并直接促进轴突生长。同时对维持听神经元的发育和正常生理功能起重要作用。BDNF 对神经细胞的保护途径主要是［34］：①通过调节细胞内钙结合蛋白及其mRNA 水平，与细胞内钙离子结合，促进钙排出，保持胞内Ca2＋浓度的稳定性，从而保护神经元免受损伤；②BDNF 通过提高胞内抗氧化酶活性，对抗自由基以促进细胞损伤的修复。用BDNF 处理培养的神经细胞，可提高胞内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的浓度，降低谷氨酸（Glu）增高所致的自由基浓度增高；BDNF可提高谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的活性，抑制由于Glu所引起的Ca2＋浓度增高；③BDNF可以抑制兴奋性氨基酸的细胞毒性。细胞损伤与兴奋性氨基酸－Glu的过量释放有直接关系。BDNF对调控NMDA 受体功能具有重要的作用，BDNF 可以通过减少NMDA 受体基因的表达，下调NMDA 受体的功能，抑制Glu的毒性。BDNF 还可以抵抗一氧化氮介导的Glu细胞毒性，以抑制兴奋性递质特别是Glu的释放，减少细胞损伤；④BDNF可以抑制细胞凋亡。BDNF可通过调节转录因子等上游元件调节神经元内基因的表达，如c－fos、c－jun 等而抑制细胞凋亡、坏死的发生，这种效应可能是通过诱导TrKB 受体的表达增高来实现的。国内外目前关于脑源性神经营养因子与耳毒性关系的研究主要体现在对螺旋神经细胞的保护机制上，而对毛细胞的保护作用机制，以及氨基糖苷类抗生素对螺旋神经节细胞的作用机制都有待进一步探讨。

4 研究展望

对耳蜗螺旋神经节的保护作用、对噪声性聋的基因治疗及对顺铂诱导的耳毒性保护作用都证实BDNF是内耳发生发展的重要营养因子。BDNF被认为是抗凋亡剂、钙通道阻滞剂、谷氨酸拮抗剂、抗氧化剂的这些作用在抗耳毒性作用中也必将起到重要作用。国外文献报道神经营养因子对听神经元的保护作用仅维持在持续给药的治疗期间［35］，也有报道脑源性神经营养因子的作用可维持到给药后2周［36］。由于作用时间太短，很难应用于临床。随着研究的不断深入，BDNF 在防护神经性聋方面也将从基础研究逐步过度到临床应用研究。根据实验结果建议以细胞为基础的神经营养因子治疗方法，在临床转染治疗过程中选择包封技术来实现神经营养因子的传递，以减少和阻止感音神经性聋听神经元的退行性变。如果与耳蜗植入后长期电极刺激结合应用，期望进一步提高听神经元的存活率，以扩大和提高耳蜗植入的效果［37］。说明神经营养因子不仅可以作为直接的治疗方式，还可以作为协同作用，进一步扩大了治疗的适应证范围，提高了现有治疗方式的治疗效果，为今后研究中选择有价值的治疗基因打下基础，以便针对不同类型的感音神经性聋采取更合理的基因治疗方式。

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