高效液相色谱-质谱串联法同时测定人血清中拉莫三嗪及卡马西平的含量Δ

陈凯云，骆利平，谢文毅，成 芳，陈海芳(.南昌大学第四附属医院药剂科，南昌 330003;.江西中医学院教育部重点实验室，南昌 330000)

拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)为苯三嗪类的广谱抗癫痫药，在临床上常与卡马西平(Carbamazepine，CBZ)联用以治疗复杂性癫痫发作。已有文献报道了LTG和CBZ的高效液相色谱分析方法，但利用LC-MS/MS同时测定两者的方法研究报道较少，且分析比较复杂。本研究旨在建立处理样品简便、检测准确、灵敏度高的LC-MS/MS分析方法同时测定人血中LTG和CBZ的含量，为临床监测血药浓度、合理用药提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦6410 QQQ LC/MS/MS，瑞士梅特勒AE-240十万分之一天平。

1.2 试药

LTG对照品(中国药品生物药品检定所提供，批号: 100775-2001)，CBZ对照品(中国药品生物药品检定所提供，批号:100142-201004)，拉莫三嗪片(批号:H20080522，葛兰素史克集团公司生产)，卡马西平片(批号:100501，上海信宜黄河制药有限公司生产)，甲醇(HPLC，TEDIA公司生产)，水为重蒸水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶0.2%甲酸水溶液，流速为0.4 m L·min－1，进样量为5 μL，柱温为30℃。流动相洗脱程序采用梯度(0 min:甲醇∶0.2%甲酸水溶液=50%∶50%;6 min:甲醇∶0.2%甲酸水溶液=60%∶40%;10 min:甲醇∶0.2%甲酸水溶液=90%∶10%; 15 min:甲醇∶0.2%甲酸水溶液=100%∶0%;15.1 min:甲醇∶0.2%甲酸水溶液=50%∶50%)洗脱。

2.2 质谱条件

采用大气压电喷雾(ESI)离子源，正离子模式;离子喷射电压为4 kV;温度为350℃;干燥气流速为10 L·min－1;压力为30 psi(1 psi=6.895 kPa);采用多反应监测(MRM):LTG检测离子对为m/z 256→145，裂解电压为135 V，裂解能量为40单位;CBZ检测离子对为m/z 237→194，裂解电压为135 V，裂解能量为15单位。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取LTG、CBZ对照品各10 mg至10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，均配制成质量浓度约为0.5 mg·L－1的LTG标准溶液、CBZ标准溶液及混合标准溶液(LTG 0.5 mg· L－1、CBZ 0.5 mg·L－1)备用。

2.4 血清样品的处理

取血清100 μL，涡旋10 s，加入乙腈200 μL，涡旋30 s，室温下以15 000 r·min－1的转速离心2 min，吸取上清液转移至进样管中，进样5 μL。

2.5 质谱分析

LTG、CBZ的准离子峰分别为m/z 256和m/z 237，二级质谱分析生成的主要碎片离子分别为 m/z 145和 m/z 194。LTG、CBZ对照品相应的二级全扫描质谱图见图1。

图1 LTG与CBZ的全扫描质谱图Fig 1 Full-scan mass spectrum of Lamotrigine and Carbamazepine

2.6 方法学论证

2.6.1 方法的专属性考查:取空白血清100 μL，按“2.4”项下方法操作，得到相应色谱图;另取空白血清100 μL3份，分别加入质量浓度均为0.5 mg·L－1的LTG标准溶液、CBZ标准溶液及混合标准溶液各10 μL，按“2.4”项下操作，得到相应色谱图。结果表明，空白血清的内源物质不干扰LTG及CBZ的测定，该法获得的色谱具有高度的专属性。

2.6.2 标准曲线和线性范围:取空白人血清8份，精密量取LTG和CBZ对照品溶液适量，配制成相当于5、20、50、100、200、300、400、500 μg·L－18个质量浓度的血浆样品，按“2.4”项下方法操作，进样5 μL，记录色谱图。以待测物质量浓度为横坐标、待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，进行加权回归计算，得回归方程分别为 YLTG=0.434 5 X－0.616 6，r= 0.998 9，范围为5.0～500.0 μg·L－1，下限为5.0 μg·mL－1; YCBZ=0.317 0 X－1.558 2，r=0.997 2，范围为5.0～500.0 μg· L－1，下限为5 μg·L－1。结果表明，CBZ和LTG血药浓度均在5～500 μg·L－1范围内线性关系良好，CBZ和LTG的定量下限均为5 μg·L－1。

2.6.3 方法的精密度试验:取空白人血清，按“2.6.2”项下方法制备质量浓度为低(10 μg·L－1)、中(50 μg·L－1)、高(100 μg· L－1)血清样品各6份，分别在同日内和周内不同日期计算日内、日间RSD。结果显示，各质量浓度的日内RSD均＜5%，日间RSD均＜7%，表明该测定方法精密、准确、重现性好，见表1。

2.6.4 准确度实验测定其方法回收率:按“2.6.2”项下方法制备质量浓度为低(10 μg·L－1)、中(50 μg·L－1)、高(100 μg· L－1)血清样品各6份，进样分析得到峰面积A，另取空白血清按“2.3”项下方法进行处理，加入适量CBZ和LTG标准工作溶液，配制成与质量控制管理(QC)样品理论进样质量浓度相同的溶液进样分析，计算绝对回收率，另取提取后的峰面积与未经提取的峰面积相比，考察绝对回收率，结果表明该方法绝对回收率均＞90%，相对回收率均＞85%，见表1。

表1 精密度及回收率试验结果(n=6，±s)Tab 1 Results of precision and recovery tests(n=6，±s)

表1 精密度及回收率试验结果(n=6，±s)Tab 1 Results of precision and recovery tests(n=6，±s)

/% LGT 10 9.93±0.40 4.03 9.49±0.62 6.50 92.31±3.样品 质量浓度/μg·L －1日内 日间质量浓度/μg·L－1 RSD/% 质量浓度/μg·L－1 RSD/% 绝对回收率/% 相对回收率95 85.02±4.00 50 48.75±2.22 4.55 49.37±2.12 5.24 96.78±4.93 85.02±4.00 100 100.30±4.16 4.37 102.75±4.49 4.37 93.89±5.50 85.02±4.00 CBZ 10 9.40±0.51 2.08 9.97±0.38 3.81 91.25±4.28 85.29±5.73 50 48.04±2.25 4.68 48.81±2.56 4.46 95.29±5.66 87.11±4.21 100 102.76±4.49 3.20 98.95±3.78 3.82 93.88±4.59 88.08±5.61

2.6.5 稳定性考察:按“2.6.2”项下方法制备质量浓度为低(10 μg·L－1)、中(50 μg·L－1)、高(100 μg·L－1)血清样品各6份，分别于室温放置0、3、6、9、12 h后测定其回收率。每种质量浓度水平每个条件的稳定性考察进行3样本分析，结果表明，处理后的血浆样品室温放置12 h内稳定(RSD＜5.8%)。同法配制低、中、高质量浓度的标准品血清样品各3份置于－20℃放置1个月，血清样品经历3次冷冻-解冷冻循环后，按“2.4”项下方法操作，测定其回收率。每种质量浓度水平每个条件的稳定性考察进行3样本分析，结果表明，样品－20℃下放置1个月，反复冻融3次性质稳定(RSD＜6.6%)。

3 讨论

3.1 流动相洗脱程序考察

本实验分别考察了等度洗脱，结果显示采用梯度洗脱程序洗脱，分离度好，保留时间较短。

3.2 质谱条件考察

本实验对先分别对LTG单对照、CBZ单对照分别进质谱进行全扫描后采用选择离子扫描模式(SIM)，分别考察了LTG单对照、CBZ单对照在不同裂解电压(120 V、130 V、135 V)和不同裂解能量(15单位、30单位、40单位)下的碎片离子峰。结果在裂解电压为135 V、裂解能量为40单位下，LTG的碎片离子m/z=145响应良好;在裂解电压为135 V、裂解能量为15单位下，CBZ的碎片离子m/z=194响应良好。最后取混合对照5 μL进样，采用MRM，设定LTG离子对为m/z 256→145，裂解电压为135 V，裂解能量为40;CBZ检测离子对为m/z 237→194，裂解电压为135 V，裂解能量为15单位。结果显示，二者的碎片离子峰响应良好。

综上所述，本研究建立的测定人血清中CBZ和LTG血药浓度的LC-MS/MS法，比以往报道的方法样品前处理简单，不需内标［1-4］，具有操作简便、快速、灵敏度高、准确性好等优点，适用于临床联合用药的血药浓度监测和药动学研究。

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［2］ 何大可，王 丽，王寅初.反相高效液相色谱法同时测定拉莫三嗪和卡马西平血药浓度［J］.药物分析杂志，2006，26(2):212-214.

［3］ 陈小陆，任 斌，肖 力，等.HPLC测定拉莫三嗪血药浓度［J］.中国药学杂志，2008，43(3):232-233.

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