细胞角蛋白19和人乳腺球蛋白在乳腺癌阴性前哨淋巴结中的表达及临床意义

左思 杨伟萍 韦长元 叶新青

乳腺癌是全身性疾病，其死亡主要原因是浸润播散和远处转移，而转移的主要途径为淋巴结转移。前哨淋巴结为区域淋巴引流中最先遭遇肿瘤细胞并最先发生转移的第一站淋巴结，其病理学结果能准确预测腋窝淋巴结的转移状态，但对于直径＜2 mm的微小转移灶常规病理HE染色难以检出，致前哨淋巴结活检(SLNB)结果假阴性而漏诊。本实验应用免疫组化SP法检测细胞角蛋白19(cytokerantin-19，CK19)和人乳腺球蛋白(human mammaglobin，hMAM)在乳腺癌阴性前哨淋巴结中的表达情况，讨论两者表达差异及与临床病理因素的关系，为临床提供治疗依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择广西医科大学附属肿瘤医院2009年2月至2010年2月临床及病理资料齐全的60例乳腺癌患者，前哨淋巴结活检均未发现转移的蜡块为研究标本。患者均为女性，临床检查均无腋窝淋巴结肿大，年龄27～75岁，平均(50.38±11.24)岁，美蓝染色法检出35例，美蓝染色联合同位素示踪法检出25例。临床TNM分期均为T1～T2 N0M0，其中T1期34例，T2期26例。外上象限26例，外下象限15例，内上象限11例，内下象限8例。病理类型浸润性导管癌52例，浸润性小叶癌5例，黏液腺癌3例。分子分型Luminal A型23例，Luminal B型13例，HER2过表达型15例，Basal-like型6例和正常乳腺样型3例。所有患者术前均未经放疗、化疗或内分泌治疗。

1.2 CK19和hMAM检测方法每个石蜡标本连续切片3张，每张厚4 μm，切片间隔20～25 μm。采用免疫组化SP法，CK19、hMAM试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司，操作步骤按试剂盒说明书进行，每批染色用已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 染色标准CK19表达于胞浆，每张乳腺癌前哨淋巴结切片胞浆中未出现棕黄色颗粒计为阴性，胞浆中出现棕黄色颗粒计为阳性。hMAM表达于胞浆，阳性细胞数和染色程度乘积进行评分划分等级，染色强度评分0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。阳性细胞所占百分比＜25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分，两者相乘0分为(-)，1～3分为(+)，4～6分为(++)，8～12分为(+++)。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件。统计分析采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

60例乳腺癌阴性前哨淋巴结CK19和hMAM检测结果，hMAM表达2例，阳性检出率为3.3%。CK19除了hMAM阳性2例外，另外检出6例，阳性检出率为13.3%。hMAM表达2例，1例(+)，1例(++)，CK19表达8例。经单因素分析，CK19表达与肿瘤T分期有关(P＜0.05)，与患者的年龄、月经状况、定位方法、肿瘤位置、病理类型、雌激素受体(ER)表达、孕激素受体(PR)表达、CerbB-2表达、Ki-67表达和分子分型均无相关(P＞0.05);hMAM表达与以上临床病理因素均无相关(P＞0.05)。见表1。

表1 乳腺癌患者阴性前哨淋巴结中CK19和hMAM的表达及与临床病理因素的关系(n，%)

3 讨论

前哨淋巴结是乳腺癌发生转移的第一站淋巴结，它的组织学特征能准确预测腋窝淋巴结是否有转移，现认为乳腺癌SLNB阴性，则无需行腋窝淋巴结清扫(ALND)，对腋窝淋巴结阴性的乳腺癌患者行ALND，并不能提高其总体生存率和延长无病生存期［1］。这对乳腺癌患者来说可以减小手术创伤、促进术后上肢功能恢复并提高术后生活质量。同时，若对无腋窝淋巴结转移的患者行ALND，破坏腋窝淋巴结的免疫屏障作用，更易于隐藏的癌灶向远处转移［2］。所以前哨淋巴结病理检查结果至关重要。但常规病理学检测前哨淋巴结阴性尚不能认为腋窝淋巴结无转移，因为常规病理HE染色对直径＜2 mm微小转移灶较难检出，有研究报道常规病检前哨淋巴结阴性患者，5年内仍有30%出现复发、转移［3］。这可能是前哨淋巴结早期出现微转移，常规病检呈假阴性而漏诊所致。统计发现，连续或多层切片HE染色、免疫组化、RT-PCR检测均可显著提高前哨淋巴结敏感性，而RT-PCR检测敏感性更高，并且少量切片即可诊断微转移，前两者联合可使微转移检出率提高9%～47%［4-5］。连续切片工作烦琐和费时，在临床应用难以开展。本实验标本为蜡块，所以采用免疫组化对阴性前哨淋巴结进行检测，以提高微转移检出率。

CK19和hMAM均在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中表达，而在间叶组织来源的淋巴结、外周血、骨髓等中不表达，因此可以作为乳腺癌的良好标志物来进行微转移灶的检测［6-7］。CK19是乳腺癌淋巴结隐匿转移癌检测的可靠基因标志之一，在上皮性肿瘤患者的前哨淋巴结中检测到CK19的表达，即表明有播散的肿瘤细胞的存在。张涛等［8］报道用CK19前哨淋巴结微转移检出率约64.7%，且微转移与肿瘤大小、CerbB-2等因素表达相关。本实验采用免疫组化方法对60例乳腺癌阴性前哨淋巴结行CK19和hMAM检测。本实验中CK19微转移检出率为13.3%(8/60)，从表1中得知，经单因素分析CK19的表达仅与T分期即乳腺肿瘤的大小相关，与其他临床病理因素均不相关，本实验的研究对象为临床检查无腋窝淋巴结肿大的早期乳腺癌患者，均处于T1～T2 N0M0，同样证实肿瘤大小与微转移相关，这也符合肿瘤的侵袭转移特性随着瘤体积增大而增强，临床分期越晚，远处转移率越高的规律，所以肿瘤的大小可用作评估该类患者微转移的风险指标。所以当乳腺癌肿瘤直径＞2 cm时，应注意阴性前哨淋巴结微转移情况。

CerbB-2基因是在乳腺癌中增殖表达的原癌基因，已证实在乳腺癌中CerbB-2的高表达可表现出较强的侵袭性，也提示有较高的转移潜能，所以这类患者肿瘤恶性程度高且易出现复发和转移。但本研究中微转移与CerbB-2的表达无相关，这可能和本研究中Luminal B型及HER2过表达型例数较多、CerbB-2表达比例较高有关。国内学者从乳腺癌患者骨髓和外周血中检测CK19等微转移，同样发现乳腺癌微转移与肿瘤大小及临床分期等临床病理因素相关［9-10］。所以检测前哨淋巴结中CK19可发现更早期微转移病灶，如联合外周血或骨髓中微转移检测，将会更好地早期发现微转移。

William等［11］检测了HE染色阴性的淋巴结中hMAM阳性表达率为33%(112/344)，且hMAM的阳性表达与组织学分级分期、St.Gallen危险度均呈正相关(P值分别0.0255与0.022)。本实验结果hMAM的检出率为3.33%(2/60)，表达强度(+)～(++)，且表达与以上临床病理因素均不相关。在本试验中hMAM这一指标检出率低，表达强度偏低，与William的结果差距较大，可能与本组中的病例数偏少和标本有关。由于本研究的标本为蜡块而非新鲜组织，并且前哨淋巴结于术中均接受快速冰冻病理检查，冰冻剩余组经常规处理接受常规HE染色，由于两次检测需获得最大平面，致使剩余组织量明显减少，并且每个蜡块仅切片3张，也是本实验阳性检测较少的原因。所以hMAM用于阴性前哨淋巴结微转移检测的灵敏度可能需要大样本实验才能明确。

Cox等［12］回顾分析2408例乳腺癌患者，发现微转移后具有重要的预后意义。总之，快速正确地诊断前哨淋巴结微转移，对乳腺癌患者手术方式，术后治疗、预后生存等均至关重要。虽然本试验样本例数较少，但仍能检测到微转移的存在，所以开展常规病检阴性前哨淋巴结微转移检测有较好的临床应用意义。

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