不同时辰电针对氯胺酮滥用大鼠腹侧苍白球酪氨酸羟化酶、c-fos表达的影响

吴 锋 熊克仁 王丽发

（皖南医学院解剖学教研室，安徽 芜湖241002）

氯胺酮（Ketamine）为非竞争性 N－甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-aspartate，NMDA）受体拮抗剂，作为一种分离性麻醉药应用于临床，其作用机制复杂，由于其具有一定的致幻作用而被滥用于各种娱乐场所，又称为“K”粉，是目前药物滥用中的一个新问题［1］。氯胺酮滥用可激活脑内奖赏通路即中脑边缘 多 巴 胺 系 统 （Mesolimbic dopamine system，MLDS），目前认为所有药物成瘾性可能是直接或间接作用于MLDS。MLDS主要结构包括中脑腹侧背盖区（ventral tegmental area，VTA）、伏隔核（Nucleus accumbens，NAc）和前额叶皮质（Prefrontal cortex，PFC），当该通路被激活时，VTA含多巴胺（Dopamine，DA）递质的DA神经元放电活动增强，通过神经纤维与NAc和PFC相联系，导致NAc及PFC的DA释放增加，导致药物成瘾［2］。但对NAc主要纤维传出核团之一的腹侧苍白球（Ventral Pallidum，VP）研究甚少，有研究表明毁损VP可明显减少吗啡依赖大鼠的觅药行为，VP是调节成瘾药物强化作用的重要部位，NAc-VP通路是药物刺激和强化的共同通路［3］。还有研究表明c-fos表达明显增强与大鼠吗啡依赖有关［4］，c-fos也参与了氯胺酮所致精神症状的分子机制［5］，而低频电针可使NAc、VP神经元c-fos表达明显减少，能治疗海洛因觅药行为［6］。但针灸施治的时辰与疗效关系密切，不同时辰针灸对肺癌病鼠脑干内神经递质影响是不同的，子时针灸组T淋巴细胞活性率最高，午时最低，卯时针灸组巨噬细胞吞噬率最强［7］，那么不同时辰电针对氯胺酮滥用成瘾大鼠VP酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase ，TH，DA 合成 的关键酶）、c-fos表达的影响如何，值得研究。

材料和方法

1.材 料及试剂

雄性SD大鼠56只，体重220±20g，清洁级，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008-0033，保持室温23±2℃，相对湿度60%－65%，自然光照，自由进水，给药前禁食12h。颗粒饲料由皖南医学院动物中心提供。将大鼠随机分为正常 对 照 组、生 理 盐 水 （10ml／kg）组、氯 胺 酮（100mg／kg）组、氯胺酮加四个时辰电针组，每组8只。盐酸氯胺酮注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号 KH090704，规格2ml：100mg）；兔抗c-fos、鼠抗TH及SABC免疫组化试剂盒（博士德公司）。

2.方 法

2.1 造模方法

采用氯胺酮100mg／kg进行大鼠腹腔注射，每天一次，连续一周，第一次给药后大鼠表现出呼吸加快、呼吸道分泌物增多，随后出现活动增多、尾巴僵直上翘的兴奋症状，随着用药次数的增多，兴奋症状明显增多，表现为扭体、站立、跳跃、清理皮毛、转圈、四脚朝天等。出现上述症状大鼠作为造模成功大鼠，用于实验研究。

2.2 电针方法

电针组于给药一周后开始，分别在子时、卯时、午时、酉时给予低频（2Hz）电针交替刺激“足三里”与“三阴交”穴（其中第一天同时刺激左侧“足三里”与“三阴交”穴，第二天同时刺激右侧“足三里”与“三阴交”穴，如此交替），持续30min，强度3V，波宽1ms，每天一次，连续一周。

2.3 指标检测方法

各组大鼠处理完毕后2h，用30mg／kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，暴露心脏，经左心室－升主动脉插管灌注固定。先快速灌注温生理盐水100ml，再灌注4℃的1%多聚甲醛磷酸缓冲液300ml，30min内灌注完毕。取脑，后固定于4%甲醛固定液中，6h后，入梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。连续切片，片厚5μm，切片分组收集。石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2去除内源性过氧化物酶5-10min，95℃-98℃电炉热修复，断电两次，5%正常羊血清封闭，置37℃温箱1h之后滴加抗TH、c-fos抗体，置湿盒内4℃过夜。第二天37℃温箱复温1h，滴加相应的生物素化的二抗，置37℃温箱2h，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素，置37℃温箱1h，DABH2O2显色10-30min。各步骤间均用0.02mol／L PBS（pH7.2-7.4）洗5min×3次，对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同，显色之后常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察。

2.4 神经元计数及图像处理

每组选取相同冠状切面的切片各16张（其中每只选取2张），参照王平宇的大鼠脑读片图谱，在10×10倍光镜下利用读数显微镜对每张切片VP区相同区域（选定1mm2的区域）的TH、c-fos阳性神经元进行计数，并用黑马病理图像分析系统测量平均灰度值。

3.统 计学处理

神经元数量和平均灰度值结果以均数±标准差（¯x±s）表示，显著性检验采用方差分析、q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1.一 般状况

氯胺酮100mg／kg第一次给药（腹腔注射，1次／d）后大鼠表现出呼吸加快、呼吸道分泌物增多，随后出现活动增多、尾巴僵直上翘的兴奋症状，随着用药次数的增多，兴奋症状明显增多，表现为扭体、站立、跳跃、清理皮毛、转圈、四脚朝天等。氯胺酮连续给药一周后停药，分别在子时、卯时、午时、酉时给予低频（2Hz）电针交替刺激“足三里”与“三阴交”穴，连续一周。午时、酉时电针组大鼠症状得到有效改善，活动接近正常大鼠；子时、卯时电针组大鼠症状改善不明显。

2.免 疫组织化学结果

2.1 各组大鼠VP TH阳性神经元数量与平均灰度值（表1，图 A1-7）

TH阳性神经元呈现棕色或棕褐色，主要为胞膜与胞浆染色，胞核不着色。与正常对照组相比，生理盐水组VP TH阳性神经元数量与细胞平均灰度值差异无统计学意义 （P＞0.05）；氯胺酮组VP TH阳性神经元数量增加 （P＜0.01），细胞平均灰度值降低（P＜0.01），有统计学意义。与氯胺酮组相比，子时电针组和卯时电针组VP TH阳性神经元数量与细胞平均灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）；午时电针组和酉时电针组VP TH阳性神经元数量减少（P＜0.01），细胞平均灰度值升高（P＜0.01），有统计学意义。

表1 各组大鼠VP TH阳性神经元数量及细胞平均灰度值（¯x±s，n＝16）Table 1 The number of TH IR positive neurons and average gray value in VP in each group（¯x±s，n＝16）

2.2 各组大鼠VP c-fos阳性神经元数量与平均灰度值（表2，图B 1-7）

c-fos阳性神经元呈现棕色或棕黄色，主要为胞膜与胞浆染色，胞核不着色。与正常对照组相比，生理盐水组VP c-fos阳性神经元数量与细胞平均灰度值差异无统计学意义 （P＞0.05）；氯胺酮组VP c-fos阳性神经元数量增加（P＜0.01），细胞平均灰度值降低（P＜0.01），有统计学意义。与氯胺酮组相比，子时电针组和卯时电针组VP c-fos阳性神经元数量与细胞平均灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）；午时电针组和酉时电针组 VP c-fos阳性神经元数量减少（P＜0.01），细胞平均灰度值升高（P＜0.01），有统计学意义。

表2 各组大鼠VP c-fos阳性神经元数量及平均灰度值（¯x±s，n＝16）Table 2 The number of c-fos IR positive neurons and average gray value in VP in each group（¯x±s，n＝16）

讨 论

VP是基底神经核和丘脑皮质环路的重要组成部分，其内神经元含有多种神经递质如DA、谷氨酸、γ－氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、神经肽等。与对运动的兴奋或抑制性调节、奖赏行为、记忆的强化有关［8］。VP作为NAc的重要投射部位之一，是调节大鼠吗啡强化效应的重要部位［3］。本实验TH结果表明氯胺酮滥用，大鼠VP TH阳性神经元数量明显增多，细胞平均灰度值明显降低，说明免疫反应阳性细胞染色越深，间接表明VP TH含量增高，DA合成增多，引起大鼠的行为学改变，提示VP也是大鼠氯胺酮成瘾强化效应的重要脑区之一。氯胺酮为非竞争性NMDA受体拮抗剂，氯胺酮滥用可激活脑内的奖赏通路即MLDS，生理状态下，VTA DA能神经元活动受到GABA能抑制性中间神经元的紧张性抑制，并且此抑制性中间神经元上存在NMDA受体，在与NMDA受体拮抗剂氯胺酮结合后，GABA能神经元活动被抑制，GABA的释放减少，取消了对于DA能神经元的紧张性抑制，使VTA DA 能神经元放电活动增加［9］。VTA通过神经纤维与NAc相联系，导致NAc DA释放增加，继而经NAc-VP通路使VP DA释放增加。许霁虹等［5］研究表明氯胺酮100mg／kg腹腔注射，注射后1h可引起大脑皮质c-fos表达增高，本实验c-fos结果表明氯胺酮100mg／kg腹腔注射连续1周后引起VP c-fos表达明显增高。c-fos在许多刺激诱导下可快速短暂地表达，随后调节反应基因的转录，可能导致谷氨酸大量异常释放，在外界刺激－转录偶联的信息传递过程中起着第三信使的作用，是许多刺激引起神经元活动的结果。临床应用氯胺酮麻醉可使脑血流量增加，脑代谢率、耗氧量也增加，氯胺酮引起的精神症状与脑代谢增加和细胞活动异常有关。氯胺酮诱导c-fos在大脑皮质和VP等脑区异常表达，提示该区域的神经元可能发生损伤，提示c-fos可能参与了氯胺酮麻醉后及滥用所致精神症状的分子机制。

氯胺酮诱导c-fos在VP异常表达，VP神经元可能发生损伤，此损伤是否为可逆性的呢？有研究表明吗啡等慢性用药可诱导NAc c-fos表达增加的主要原因可能是由于内源性DA释放所致，引起Fos蛋白在细胞内表达，致神经毒性，导致神经元受损伤，但这种损伤可能是可逆转的［4］。药物成瘾是一种慢性脑病，而针灸则具有神经调节作用。针灸疗法具有简便、安全、价廉等特点，被广泛用于临床。在戒毒方面，针灸也取得一定的疗效。电针刺激“神门”穴明显降低吗啡成瘾大鼠NAc DA的释放［10］。孙丽敏等［6］研究报道低频电针刺激“三阴交”穴可使VP等脑区内神经元c-fos表达明显减少，能治疗海洛因觅药行为。本实验通过不同时辰电针交替针刺“足三里”和“三阴交”穴治疗氯胺酮滥用成瘾大鼠一周后，午时和酉时电针可明显降低VP TH和c-fos阳性神经元的数量，增高细胞平均灰度值，说明TH、c-fos免疫反应阳性细胞染色越深，提示午时和酉时电针可减少VP DA的合成，VP c-fos表达也明显降低。电针能明显改善氯胺酮滥用大鼠的成瘾症状并使其活动接近正常大鼠。提示电针的这种作用机制可能为电针可促使VP等脑区神经元GABA的释放，恢复GABA对DA的抑制，减少DA的合成、释放，继而减弱c-fos的表达，调节VP等成瘾相关脑区的神经适应，修复可逆性的神经元损伤，改善症状。但本实验还发现子时和卯时电针对氯胺酮滥用大鼠VP TH、c-fos表达的改变不明显，表明电针对TH、c-fos表达的影响有时辰差异。我室曾研究表明2Hz低频电针针刺大鼠“足三里”穴对大鼠杏仁核一氧化氮合酶表达的影响有时辰差异［11］，陈晓莉等［12］研究表明不同时辰针刺家兔“合谷”穴，对降低血浆5-羟色胺的含量也存在时辰差异。这种时辰差异性可能与机体的昼夜节律性变化有关，具体机制还有待进一步研究。

电针对氯胺酮等药物滥用成瘾的戒毒治疗有效，但其机制复杂，涉及神经生化机制、神经生理机制及其他机制等，目前确切机制仍不完全清楚，还需进行大量深入的研究。本实验结果提示在应用电针戒毒治疗时，应考虑时间因素对疗效的影响，以提高治疗效果。

［1］杨菊，卞士中.氯胺酮滥用的研究进展.法医学杂志，2007，23（4）：312-315

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［3］贺世明，高国栋，王学廉.毁损腹侧苍白球对大鼠觅药行为的影响.中国药物依赖性杂志，2001，10（3）：182-184

［4］Liu J L，Nickolenko J，Sharp FR.Morphine induces cfos and junB in striatum and nucleus accumbens Via D1 and N-methyl-D-aspartate recptors.Neurobiology，1994，91（18）：8537-8541

［5］许霁虹，张铁铮，刘晓江，等.氯胺酮麻醉引起c-fos基因在大鼠大脑皮质的表达.临床麻醉学杂志，2005，21（2）：116-118

［6］孙丽敏，甄利波，刘宜军，等.低频电针对海洛因觅药行为相关脑区FosB蛋白表达的影响.中国针灸，2006，26（11）：833-837

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［11］赵健，熊波，李怀斌，等.不同时辰电针对大鼠杏仁核一氧化氮合酶表达的影响.中国组织化学与细胞化学杂志，2004，13（4）：469-472

［12］陈晓莉，宋开源.不同时辰电针软组织损伤家兔合谷穴的镇痛作用及对血浆5-羟色胺的影响.成都中医药大学学报，2001，24（3）：25-26

图 版 说 明

（箭头所指为阳性神经元）

图A1 正常对照组VP TH阳性神经元 ×100

图A2 生理盐水组VP TH阳性神经元 ×100

图A3 氯胺酮组VP TH阳性神经元 ×100

图A4 子时电针组VP TH阳性神经元 ×100

图A5 卯时电针组VP TH阳性神经元 ×100

图A6 午时电针组VP TH阳性神经元 ×100

图A7 酉时电针组VP TH阳性神经元 ×100

图B1 正常对照组VP c-fos阳性神经元 ×100

图B2 生理盐水组VP c-fos阳性神经元 ×100

图B3 氯胺酮组VP c-fos阳性神经元 ×100

图B4 子时电针组VP c-fos阳性神经元 ×100

图B5 卯时电针组VP c-fos阳性神经元 ×100

图B6 午时电针组VP c-fos阳性神经元 ×100

图B7 酉时电针组VP c-fos阳性神经元 ×100

EXPLANATION OF FIGURES

（Chart arrow referring to positive neurons）

Fig.A1TH IR positive neurons in the VP of normal control group×100

Fig.A2TH IR positive neurons in the VP of normal saline group×100

Fig.A3TH IR positive neurons in the VP of ketamine group×100

Fig.A4TH IR positive neurons in the VP of Zi Shi EA group×100

Fig.A5TH IR positive neurons in the VP of Mao Shi EA group×100

Fig.A6TH IR positive neurons in the VP of Wu Shi EA group×100

Fig.A7TH IR positive neurons in the VP of You Shi EA group×100

Fig.B1c-fos positive neurons in the VP of normal control group×100

Fig.B2c-fos positive neurons in the VP of normal saline group×100

Fig.B3c-fos positive neurons in the VP of ketamine group×100

Fig.B4c-fos positive neurons in the VP of Zi Shi EA group×100

Fig.B5c-fos positive neurons in the VP of Mao Shi EA group×100

Fig.B6c-fos positive neurons in the VP of Wu Shi EA group×100

Fig.B7c-fos positive neurons in the VP of You Shi EA group×100