协同刺激分子B7-H3在脊椎动物中的分布及其演化①

孙 静 傅丰庆 顾文超 申志勇 张学光 (苏州卫生职业技术学院，苏州215009)

协同刺激分子B7-H3在脊椎动物中的分布及其演化①

孙 静 傅丰庆②顾文超②申志勇②张学光②(苏州卫生职业技术学院，苏州215009)

目的:探讨B7-H3分子2种异构体在不同物种中的分布及其演化模式以辅助研究B7-H3分子的生物学功能。方法:通过生物信息学方法从各类数据库中搜索脊椎动物各物种的B7-H3分子序列，分析其结构域的数量及剪切形式预测异构体的分布;获取代表性物种的组织抽提RNA，PCR验证预测结果;计算各物种B7-H3分子中V1C1和V2C2的dN和dS比。结果:获取了38个物种的B7-H3序列，其中豚鼠、家犬、非洲象、牛、熊猫、蝙蝠及高级灵长类动物如黑猩猩、大猩猩、猴等物种中存在2种剪切体;RT-PCR方法证实了2种剪切体的表达。各物种V1C1与V2C2序列的非同义突变(dN)大于同义突变(dS)值。结论:B7-H3分子最早以2IgB7-H3形式存在于硬骨鱼动物中，在高级哺乳动物中出现了2种异构体;且在自然界压力选择下发生了净化选择，并未产生新的生物学功能。

B7-H3;异构体;表达;演化

B7-H3分子是近年来新发现的B7家族的成员之一，与其它B7家族成员相比，该分子的显著特点在于:第一:小鼠仅存在一种类型B7-H3分子，而人类的B7-H3分子有2种不同的剪切体:B7-H3 (2IgB7-H3)和 B7-H3b(4IgB7-H3)[1，2]。第二:该分子的生物学功能至今尚未明确，正性和负性作用均有报道[3-6]。生物学功能的不明确除和其受体未知相关外，还可能与其异构体的存在有密切关系，因此回答为何小鼠中仅存在一种亚型而人类存在两种的科学问题以及明确该两种异构体在不同物种中的分布，对了解该分子的生物学功能具有重要的意义。

人的B7-H3分子仅由IgV-IgC 2个免疫球蛋白结构域组成，如图1所示，故又称为2IgB7-H3(B7-H3VC);而B7-H3b分子胞外段由 IgV1-IgC1-IgV2-IgC24个免疫球蛋白结构域组成，因此称为4IgB7-H3(B7-H3VCVC)。基因序列研究发现4IgB7-H3胞外段4个结构域是重复并排的V1C1V2C2，为2IgB7-H3外显子复制的结果[1，2]。本研究拟通过各物种B7-H3序列分析和序列计算推导B7-H3分子2种剪切异构体的分布形式及基因演化模式以为研究该分子的生物学功能奠定基础。

图1 人B7-H3分子基因结构图示Fig.1 The gene seructure of human B7-H3 molecule

1 材料与方法

1.1 主要软件网址和试剂材料

1.1.1 数据库 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中GENENucleotideProtein数据库;ENSEMBL数据库:http://www.ensembl.org/index.html;基因研究所 http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/tgipage.html;斑马鱼基因数据库:http://zfin.org/cgi-bin/ webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg。Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood(PAML)软件用于基因dS/dN值的计算。

1.1.2 试剂材料 LATaq酶和限制性内切酶购自日本TaKaRa公司;TRIzol试剂购自美国Gibco公司;琼脂粉(日本进口分装)购自上海华美公司;小量质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自Axygen公司;载体 PMDT-19购自 Invitrogen公司;大肠杆菌Top10由本所保种;引物合成和基因测序送往南京金思特生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 B7-H3分子数据的整合、收集 为搜集各物种所有 B7-H3序列，本研究通过以“B7-H3 OR B7H3 OR CD276”为关键词搜索多个数据库如:NCBI的 GENENucleotideProtein和 ENSEMBL，从搜索结果中提取出现“B7H1 OR B7-H1 OR B7H2 OR B7-H2 OR B7H4 OR B7-H4”OR“This record was discontinued”的条目，手工检验是否存在假阳性;以“cd276”为关键词搜索斑马鱼基因数据库:http:// zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_ home.apg;以相似性搜索对鳗鱼可能B7-H3序列进行查 找:http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/ runAlignment?db=Brafl1＆advanced=1;通过数据库之间的交叉索引，得到基因以及蛋白对应的mRNA序列，将所有的mRNA与各自的染色体序列BLAT定位，去除冗余。

1.2.2 B7-H3剪切体分布分析 获取各物种的B7-H3基因后，分析胞外段结构域数量及特点，预测剪切异构体的数量。

1.2.3 PCR验证生物信息学结果 根据获取各物种B7-H3序列，进行碱基序列比对从而且设计保守

引

物，引物序列如下:上游引物 JBL:GGCAGCTTCACCTGCTTCGTGAG;下游引物JBR:TTGCGCACCAGGCAGCTGTAGGT。TRizol抽提动物肝脏RNA，抽提人及猴外周血活化淋巴细胞RNA。以Olig dT为引物，总RNA为模板，进行反转录合成cDNA第一条链。取cDNA 1 μl为模板，加入B7-H3上下游引物和内参引物进行PCR。PCR反应扩增条件为: 94℃，5分钟;94℃，30 秒;55℃，30 秒;72℃，120 秒(35个循环);72℃，10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 2IgB7-H3 与4IgB7-H3 分子 dN/dS的计算为观察B7-H3基因在进化过程中功能的变化，我们通过PAML软件计算其dN/dS的比值。具体操作步骤如下:①调取各基因的CDS序列，输入到MEGA4软件中，翻译成氨基酸序列后进行序列比对，比对结束后再转换成碱基序列，按照Fas格式保存。②将5.1的文件转到 PAML4软件中BIN文件夹下，用Per1脚本程序将其转成Phylip格式，在文件起始端加上I。③用“test.pl”命令将fas格式转成phy的格式，在MS_DOS界面下运行ctl.文件。

2 结果

图2 B7-H3同源性引物扩增B7-H3基因Fig.2 PCR analysis of different RNA samples using B7-H3-specific primer

表1 各物种B7-H3基因Tab.1 All B7-H3 genes searched from available data

2.1 获取38个物种的B7-H3序列 经过对各类数据库的搜索比对，我们获取了38个物种的B7-H3基因(如表1所示)，分别为:人、小鼠、大鼠、原鸡、黑猩猩、家犬、牛、猕猴、短尾猴、非洲蟾蜍、野猪、珍珠鸟、蜥蜴、狨猴、豚鼠、犰狳、马、刺猬、猫、三刺鱼、大猩猩、非洲象、袋鼠、狐猴、鸭嘴兽、蹄兔、猩猩、果蝠、松鼠、树鼩、青锵、河豚、海豚、羊驼。2.2 B7-H3基因的表达模式分析 经过对各物种B7-H3基因组结构如外显子的数量、结构域数目等分析发现4IgB7-H3除表达人组织和细胞中外，还可表达于豚鼠、野猪、牛、家犬、非洲象以及猩猩、猴等高级灵长类动物中。这些物种4IgB7-H3分子的特性描述见表2。该分子外显子个数为9或10个，包含4个免疫球蛋白结构域:V1C1V2C2，蛋白质氨基酸数量在530左右。为验证生物信息学预测的4IgB7-H3表达模式，我们提取了家犬、豚鼠、牛、羊、小鼠、大鼠以及猴子等物种的肝脏组织或者活化淋巴细胞细胞的 RNA，进行 RT-PCR。结果显示:用B7-H3同源性引物可以从家犬、豚鼠、牛以及猴的cDNA中可以扩增得到两条特异性条带，一条分子量较大，位于1 000 bp左右，另一条分子量较小，位于300 bp左右(图2)。经过测序Blast比对发现1 000 bp条带代表4IgB7-H3的剪切本，300 bp条带代表2IgB7-H3的剪切本(图3)。

2.3 基因复制后的环境选择压力 非同义替换率与同义替换率的比值(dN/dS)是测验编码序列所经历的环境选择压力的重要指标。若一对同源序列的dN/dS＜1表示这对同源序列在基因复制后经历了纯化选择的作用;若dN/dS≈1表示同源序列在基因复制之后经历了自然选择的作用;而dN/dS＞1则表示经历了正选择作用。为研究B7-H3分子的2种剪切体在物种进化过程中经历了何种选择，是否会出现新的功能，本研究利用PAML软件计算各物种dN/dS的比值，结果显示在除各物种B7-H3dN/dS的比值计算中，分值远小于1(表3)。

图3 犬、牛、猴、豚鼠B7-H3片段测序结果Fig.3 The sequencing results of B7-H3 of fragment in dog，cow ，monkey and guinea pigs

表2 各物种4IgB7-H3分子的特性描述Tab.2 Properties of 4IgB7-H3 in some vertebrates

表3 各物种B7-H3 dN/dS的比值Tab.3 The dN/dSratio of B7-H3 in various vertebrates

3 讨论

生物信息学是在数学、计算机科学和生命科学的基础上形成的一门新型交叉学科，随着生物技术和计算机技术的迅猛发展，生物信息学已经成为目前最为活跃的新型学科之一。其已越来越广泛应用于辅助研究生命科学，为科学研究提供假设和推测，降低研究费用、缩短研究周期。

B7-H3分子是新进发现的免疫协同刺激分子，其在2000年首次从人树突细胞cDNA文库中发现[7]。B7-H3分子与其它B7家族成员相比，该分子的显著的特点在于:第一:小鼠中仅存在一种类型B7-H3，而人的B7-H3分子有2种不同的剪切体: 2IgB7-H3和4IgB7-H3;第二:该分子的生物学功能至今尚未明确，正性和负性作用均有报道。基因的异构体在不同物种中的分布表达可以为生物学功能的研究提供帮助。多物种完整的基因组序列以及各类完善的核苷酸和氨基酸数据库可以为研究B7-H3异构体的分布提供基础。通过生物信息学研究方法我们预测4IgB7-H3除在人细胞和组织表达外，还可以表达在豚鼠、野猪、牛、家犬、非洲象以及猩猩、猴等高级灵长类动物中，继而我们通过分子生物学研究方法验证了生物信息学预测的结果。

功能性蛋白质中的大部分氨基酸均处于结构和功能的环境压力下:正性选择对蛋白质的新基序或者新功能的产生起到重要的作用[8]，表现在基因核苷酸序列改变上为非同义突变率大于同义突变(dN/dS＞1);净化选择指在自然选择的环境压力下，没有带来较多的氨基酸改变以产生新的蛋白质基序和新的功能。通过dN/dS计算我们得出B7-H3分子两种异构体在环境压力下没有产生正性选择，即在进化史上B7-H3分子未产生功能性分歧。

该部分研究工作对我们进一步明确和研究协同刺激分子B7-H3的生物学功能奠定了基础，但2种异构体之间是否具有功能分歧尚待进一步研究。

1 Sun M，Richards S，Prasad D V et al.Characterization of mouse and human B7-H3 genes[J].J Immunol，2002;168(12):6294-6297.

2 Ling V，Wu P W，Spaulding V et al.Duplication of primate and rodent B7-H3 immunoglobulin V-and C-like domains:divergent history of functional redundancy and exon loss[J].Genomics，2003;82 (3):365-377.

3 Suh W K，Gajewska B U，Okada H et al.The B7 family member B7-H3 preferentially down-regulates T helper type 1-mediated immune responses[J].Nat Immunol，2003;4(9):899-906.

4 Sun X，Vale M，Leung E et al.Mouse B7-H3 induces antitumor immunity[J].Gene Ther，2003;10(20):1728-1734.

5 Leitner J，Klauser C，Pickl W F et al.B7-H3 is a potent inhibitor of human T-cell activation:No evidence for B7-H3 and TREML2 interaction[J].Eur J Immunol，2009;39(7):1754-1764.

6 Yan R H，Zhang G B，Sun J et al.Expression of mouse B7-H3-Fc fusion protein and characterization of its bioactivity[J].Chinese J Cellular Mol Immu，2010;26(11):1067-1069.

7 Chapoval A I，Ni J，Lau J S et al.B7-H3:a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production[J].Nat Immunol，2001;2(3):269-274.

8 Yang F，Waldbieser G C，Lobb C J et al.The nucleotide targets of somatic mutation and the role of selection in immunoglobulin heavy chains of a teleost fish[J].J Immunol，2006;176(3):1655-1667.

[收稿2012-03-20 修回2012-05-16]

(编辑 许四平)

The distribution of B7-H3 in various vertebrate and the evolution of this molecule

SUN Jing，FU Feng-Qing，GU Wen-Chao，SHEN Zhi-Yong，ZHANG Xue-Guang.Suzhou Health Technology College，Suzhou 215001，China

Objective:To discuss the distribution of B7-H3 two isoforms in various invertebrates and its evolution model to help researching the function of B7-H3.MethodsThe various B7-H3 sequences were searched in various databases through bioinformatics methods and analyzed the number of structure domains and the splicing forms to deduce the distribution of B7-H3 in various species.PCR analysis after acquiring the RNA from representative species were performed to verified the prediction.The calculation of ration of dNand dSwere also done.ResultsWe acquired thirty-eight B7-H3 sequences and 4IgB7-H3 was also presented in guniea pigs，dogs，african elephants，panda，bat and higher primate animals，which were verified by PCR analysis.The dNvalule of V1C1and V2C2sequences was greater than dSvalue.ConclusionB7-H3 was earliest expressed in teleost with the form of 2IgB7-H3 and the function of B7-H3 was consistent in evolution.

B7-H3;Isoform;Expression;Evolution

R392.12

A

1000-484X(2012)08-0675-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.001①本文受国家自然科学基金资助项目(31100626)和江苏省自然科学基金(BK2011320)的资助

②苏州大学生物技术研究所，苏州215000

孙 静(1981年-)，女，讲师，主要从事分子免疫与肿瘤免疫学研究，E-mail:jsun@szhct.edu.cn。