黄芩苷逆转人肝癌细胞耐药株Bel-7402/ADM多药耐药性的相关机制研究

王术华

黄芩苷逆转人肝癌细胞耐药株Bel-7402/ADM多药耐药性的相关机制研究

王术华

目的考察黄芩苷对人肝癌耐药细胞Bel-7402/ADM多药耐药性的逆转机制。方法MTT法考察Baicalin对人肝癌多药耐药细胞的逆转作用。结果 Baicalin逆转Bel-7402/ADM多药耐药性的机制可能与抑制MDR1部分基因产物P-gp、MRP、GSH/GST的表达和诱导细胞凋亡有关。结论Baicalin可能通过抑制MDR1部分基因产物P-gp、MRP、GSH/GST的表达和诱导细胞凋亡逆转Bel-7402/ADM的多药耐药性。

黄芩苷;Bel-7402;多药耐药;逆转

肿瘤治疗由于长期使用化疗药物使患者的癌细胞对药物产生耐受性即多药耐药性(MDR)。MDR的发生通常是由多种机制共同作用，如P-gp的外排泵机制［1-3］、GST的改变［4］等。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 黄芩苷(北京北纳创联生物技术研究院);盐酸阿霉素(ADM)(浙江海正药业股份有限公司);丝裂霉素(MMC)(协和发酵工业株式会社);Bel-7402、Bel-7402/AMD(购自中科院上海细胞生物学研究所);CO2培养箱、流式细胞仪(美国Coulter公司);倒置显微镜(日本Nikon公司);MTT、P-gp单抗、单抗羊抗鼠荧光标记杭体(美国Sigma公司)。

1.2 细胞的复苏、培养 肝癌细胞Bel-7402培养于含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液中，肝癌耐药细胞株BEL7402/ADM培养于含10%小牛血清及0.3μg/m l的阿霉素的RPMI-1640培养液中，实验一周前于无阿霉素的培养液中培养。

1.3 MTT法考察Baicalin对人肝癌多药耐药细胞的逆转作用 细胞以1×106L的密度接种于96孔培养板中，孵育24h后，加入不同浓度的 ADM、MMC、DDP及Baicalin，继续培养48h，然后加入 MTT液，培养5h后，加入10%SDS，37℃过夜，用酶标仪测定吸光度(OD值)。

1.4 流式细胞仪测定P-gp、MRP蛋白、GSH/GST表达 将未经Baicalin处理和经过Baicalin处理过的BEL-7402/ADM细胞制备成细胞悬液(细胞密度大于1×106个/ml)，PBS清洗两遍，随后分别加入P-gp、MRP、GSH/GST鼠抗人单克隆抗体，以鼠抗人isotype-matched单克隆抗体为内对照，4℃孵育1h后，再分别加入羊抗鼠荧光标记抗体。再于4℃下孵育30min，应用流式细胞仪对荧光度进行测定。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 每组收集5×105个细胞，用PBS溶液(含2%牛血清白蛋白)洗涤2次，分别加入FITC标记的AnnexinV和PI，避光放置1h后，流式细胞仪检测，每次读取10000个细胞，通过Cell Quest软件进行数据分析。凋亡率(%)=(AnnexinV+PI+细胞数+AnnexinV+PI-细胞数)/100。

2 结果

2.1 黄芩苷对于Bel-7402/ADM多药耐药性的逆转作用表1中AMD、MMC、VCR对Bel-7402/AMD的IC50均显著低于Bel-7402/ADM经Baicalin处理的 IC50，可见Baicalin对Bel-7402/ADM的多药耐药性具有一定的逆转作用。

表1 黄芩苷对Bel-7402/ADM多药耐药性的逆转作用结果(±s，n=3)

表1 黄芩苷对Bel-7402/ADM多药耐药性的逆转作用结果(±s，n=3)

注:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

药物IC50/μmol/L Bel-7402/ADM Bel-7402 Bel-7402/ADM-Baicalin(100μmol/L)Bel-7402/ADM-Baicalin(200μmol/L)Bel-7402/ADM-Baicalin(300μmol/L)AMD 30.32±1.65 0.35±0.03 18.63±1.92 12.43±1.02* 4.79±0.42＊＊MMC 35.64±1.96 1.12±0.05 23.58±1.34 16.43±1.29* 6.82±0.38＊＊VCR 18.26±1.29 0.11±0.02 15.36±1.91 8.31±0.64* 7.65±0.66＊＊

2.2 流式细胞仪检测Baicalin对Bel-7402/ADM中MDR1基因部分表达产物的影响 Bel-7402/ADM经Baicalin处理后，MDR1基因的表达产物P-gp、MRP、GSH/GST的表达均受到抑制，结果表明Baicalin逆转Bel-7402/ADM多药耐药性的机制可能与抑制MDR1部分基因产物P-gp、MRP、GSH/GST的表达有关。

表2 流式细胞仪测定P-gp、MRP、GSH/GST荧光细胞的染色率

2.3 流式细胞仪检测Baicalin对Bel-7402/ADM细胞凋亡的影响 图1结果显示，经Baicalin处理过的Bel-7402/ADM细胞对AMD的敏感性显著提高，其细胞凋亡率最高。结果表明，Baicalin对Bel-7402/ADM多药耐药性的逆转作用可能与诱导细胞凋亡有关。

图1 流式细胞仪测定细胞凋亡率

3 小结

本文通过考察黄芩苷对Bel-7402/AMD的多药耐药性的逆转情况研究，可知黄芩苷可以逆转Bel-7402/AMD的多药耐药性其作用机制可能与MDR1部分基因产物的过度表达有关，竞争性的饱和细胞膜表面的P-gp通道可能是黄芩苷抑制P-gp的主要作用机制。

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［2］ 立彦，王自正．P-gp介导的肿瘤多药耐药逆转研究进展．放射免疫学杂志，2005，18(2):133．

［3］ 陈永刚，汪选斌．川芎嗪逆转肿瘤多药耐药的研究进展．中国药房，2009，20(21):1675-1676．

［4］ 李映良，金先庆．谷胱甘肽-S-转移酶与肿瘤多药耐药．儿科药学杂志，2007，13(4):73-76．

Themultidrug-resistantmechanism study of reverse effect of Baicalin for hepatocellular carcinoma cell

line(Bel7402/ADM)

WANG Shu-hua．Panjin College of Vocational and Technical，Panjin 124010，China

ObjectiveTo study themechanism that Baicalin reverse MDR of Bel-7402.M ethods U-sing MTTmethord，analyse reverse effect of Baicalin on MDR of Bel-7402.Results Themechanism which Baicalin reversed the multidrug resistance of Bel-7402/ADM may be associated with inhibition part of the gene product of MDR1，such as P-gp，MRP and GSH/GST over-expression and induction of apoptosis．Conclusion

Baicalin may reverse Bel-7402/ADM in multidrug resistance by inhibiting over-expression of part of the gene product in MDR1(P-gp、MRP and GSH/GST)and induced cells apoptosis．

Baicalin;Bel-7402;MDR;Reverse

124010盘锦职业技术学院