山东汉族骨髓供者HLA-A*02组基因多态性DNA测序分型研究

董 魁，贾 挺，刘 丽，姜其声，金孟民，林海涛，吴晓玲，庄云龙

(山东省血液中心，济南250014)

人类白细胞抗原(HLA)位于6号染色体短臂区域，是由一组紧密连锁的基因座所组成的具有高度多态性的遗传复合体。HLA 是机体内特异性免疫识别和免疫应答的主要成分，是影响造血干细胞移植成功的关键因素之一，具有显著的人种、民族和地域差异。截至2011年4月，HLA-A位点的等位基因数目已达1 601个，其中HLA-A*02家族包含了405个等位基因。HLA-A*02等位基因在不同地区和种族中的分布存在较大差异，且该基因家族某些等位基因错配会导致接受造血干细胞移植的患者发生重度急性移植物抗宿主病(aGVHD)，而该基因家族的另一些错配对移植结果无不良影响［1，2］。HLA-A*02是山东骨髓库中最主要的HLA-A等位基因之一，其等位基因水平多态性尚无资料积累。本研究旨在调查分析山东骨髓库汉族人群HLA-A *02位点各等位基因的分布情况，初步评估山东汉族人群HLA-A*02位点匹配情况及移植风险，为HLA-A*02患者在山东骨髓库寻找合适的供者提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 随机选取750例山东汉族骨髓志愿捐献者(男401例、女349例，年龄23～45岁，平均36岁)的EDTA抗凝全血。

1.2 HLA-A*02等位基因检测 采用 EZ Bead system-32 DNA提取工作站提取DNA并测定OD260和OD280值，调整DNA浓度。以提取的DNA为模板，Taq酶(0.037 5 U)和包含引物(1 μM)等的混合物共10 μL;PCR反应体系扩增HLA-A基因的外显子和内含子序列。PCR扩增反应参数为96℃、2 min，1个循环;96℃、30 s，65℃、30 s，5个循环;72℃、120 s，96℃、30，62℃、30 s，35个循环;72℃、120 s，10℃、4 h。反应结束后取2.5 μL于1.5%的琼脂糖凝胶上检验扩增产物。在对应阳性孔内的EP管中加入FastAP(1 U/μL)0.8 μL和Exonuclease I(20 U/μL)0.2 μL，混匀后于PCR仪中37℃、15 min，85℃、15 min。依照电泳图稀释PCR产物后将各位点PCR产物1 μL分别转移到标记好的扩增板对应位置，取380 μL(配100个PCR混合物)各种Sequencing Primer Mix，分别置于16个1.5 mL洁净的离心管内，再分别加入20 μL BigDye，混匀后，取各混合物4 μL加入到对应扩增板孔，共5 μL PCR反应体系，双向单链扩增HLA-A基因的2/3/4外显子。Sequencing PCR反应参数为96℃、1 min，1个循环;96℃、100 s，60℃、120 s，40个循环;10℃、4 h。扩增结束后，向每孔中加入125 mM EDTA 2.5 μL，混匀后，加入无水乙醇15 μL，再充分混匀，室温避光10 min。2 250 g离心30 min。将板倒置于吸水纸上，180 g再离心1 min。70%乙醇洗涤干燥后，每孔加入甲酰胺10 μL。置于3730测序仪上检测。测序后导出的结果由ATF1.0.2.41(Conexio Genomics)软件分析，依据的HLA数据库版本为08/ 13/10。观察HLA-A*02的基因频率、等位基因构成比、血清学组特异性频率分布，对HLA-A*02阳性标本行高分辨分型，直接计数法得到HLA-A*02各等位基因的观察数，并计算各等位基因频率。结果与不同国家和地区人群HLA-A*02各等位基因分布情况比较。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件行统计学处理。不同人群间HLA-A*02等位基因频率分布比较采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLA-A*02的基因检测情况 750份标本共363份HLA-A*02阳性，HLA-A*02的基因频率为0.288。共检出6种HLA-A*02等位基因，分属3种血清学特异性，各等位基因频率、等位基因构成比及相应血清学特异性基因频率见表1。

表1 750份标本HLA-A*02基因频率、等位基因构成比和血清学组特异性频率分布

2.2 363份HLA-A*02阳性标本HLA-A*02高分辨分型 见表2。其中以A*0201 A*1101分型最常见，血清学组特异性以A2、A11观察数目最多。

表2 750份样品中HLA-A*02等位基因主要组合和血清学组特异性组合分布

2.3 不同国家和地区人群HLA-A*02各等位基因分布 山东汉族骨髓供者与其他人群HLA-A*02等位基因分布及其频率比较见表3。山东汉族以A *0201(A2)为优势基因，日本和韩国人群同山东汉族一致，但与韩国人群中A*0201的分布相比差异显著。香港、四川和台湾人群中则以A*0207(A2)为优势基因，与山东汉族中的该基因分布相比有显著性差异。

表3 不同国家和地区人群HLA-A*02各等位基因分布

3 讨论

研究发现，A*0201是北方汉族人群的优势基因［8］，而 A*0207是南方汉族人群的优势基因［3～5］，本研究结果显示，HLA-A*0201基因频率最高(0.137)，A*0210基因频率最低;以A*0201在HLA-A*02中的构成比最高(47.56%)，即山东骨髓库中A*0201是最主要的HLA-A*02等位基因，此符合北方汉族的特征。除优势基因不同外，山东汉族A*0206基因构成比高于香港、四川和台湾人群，而A*0207基因构成比却低于香港、四川和台湾人群。山东汉族A*0203的构成比低于香港、四川和台湾人群，这也符合A*0203是南方汉族人群中的一个常见基因的特征。以上结果表明山东汉族HLA-A*02等位基因的总体分布格局与香港、四川和台湾人群存在明显差异。值得注意的是，中国人群A*0203基因的构成比均明显高于日本和韩国人群，表明日本和韩国人群中HLA-A*02等位基因分布与中国人群之间存在较大差异。A*0205属于另外一个HLA-A*02亚群，与其余5个等位基因相比，在基因序列和进化关系上存在较大差异，这一亚群在亚裔人群中很罕见［9］。

研究HLA-A*02位点的匹配情况对探讨移植的风险具有深远的临床意义。Kawase等［1］发现，HLA-A*0201者接受A*0206的移植物以及A* 0207者接受 A*0206的移植物，其病死率和aGVHD的发病率均会显著增加。Morishima等［2］也发现了类似的移植案例，同HLA-A等位基因匹配的移植相比，A*0201/A*0206错配的移植受者病死率显著增高，且aGVHD发病率有增加的趋势。这些报道表明，含有A*0206的错配会增大造血干细胞移植失败的风险，A*0206不适合作为A*0201和A*0207的供者。山东汉族人群A*0206的基因频率相对较高，A*0206和A*0201等位基因相对频率之和超过70% ，与香港、四川及台湾人群相比，山东骨髓库汉族捐献者由A*0201与A*0206错配引起的移植风险较高。值得注意的是，上述报道中其他A*02的等位基因错配的供患者人数均较少，此可能会掩盖一些涉及其他等位基因的禁忌错配，还有待于进一步研究。我们认为，在衡量HLA等位基因群体分布对造血干细胞移植的影响时，除多态性水平比较外，分析主要的错配类型对移植效果的影响亦是非常必要的。

［1］Kawase T，Morishima Y，Matsuo K，et al.High-risk HLA allele mismatch combinations responsible for severe acute graft-versus-host disease and implication for its molecular mechanism［J］.Blood，2007，110(7):2235-2241.

［2］Morishima Y，Kawase T，Malkki M，et al.Effect of HLA-A2 allele disparity on clinical outcome in hematopoietic cell transplantation from unrelated donors［J］.Tissue Antigens，2007，69(Suppl 1): 31-35.

［3］Middleton D，Hawkins BR，Williams F，et al.HLA class I allele distribution of a Hong Kong Chinese population based on high-resolution PCR-SSOP typing［J］.Tissue Antigens，2004，63(6):555-561.

［4］郑纯兴，罗玫，王珏，等.四川骨髓库汉族人群HLA-A*02等位基因分布［J］.中国输血杂志，2010，23(4):285-288.

［5］Yang KL，Chen SP，Shyr MH，et al.High-resolution human leukocyte antigen(HLA)haplotypes and linkage disequilibrium of HLA-B and-C and HLA-DRB1 and-DQB1 alleles in a Taiwanese population［J］.Hum Immunol，2009，70(4):269-276.

［6］Saito S，Ota S，Yamada E，et al.Allele frequencies and haplotypic associations defined by allelic DNA typing at HLA class I and class II loci in the Japanese population［J］.Tissue Antigens，2000，56 (6):522-529.

［7］Lee KW，Oh DH，Lee C，et al.Allelic and haplotypic diversity of HLA-A，-B，-C，-DRB1，and-DQB1 genes in the Korean population［J］.Tissue Antigens，2000，65(5):437-447.

［8］程良红，金士正，高素青，等.中国南北汉族人群HLA-A*02等位基因的分布差异［J］.第一军医大学学报，2005，25(3):321-324.

［9］任素萍.HLA-A2分子生物学研究进展［J］.国外医学:分子生物学分册，1999，21(3):170-174.