Ad-hTIMP1感染对Hcy刺激人脐静脉内皮细胞MMP1、MMP9、TIMP1 mRNA表达的影响

李 汇，毛用敏，赵莉莉，崔让庄，王佩显

(1天津医科大学总医院，天津300052;2天津市胸科医院)

金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是基质金属蛋白酶(MMPs)的内源性特异性抑制剂，MMPs是降解细胞外基质(ECM)成分的主要酶系［1］。近年研究［2］发现，动脉粥样硬化(AS)的病理过程与MMPs/TIMPs的失衡密切相关，而高水平同型半胱氨酸(Hcy)可以通过影响血管内皮细胞MMPs的表达，促进ECM的降解，进而降低AS斑块的稳定性［3］。本研究利用腺病毒载体系统AdEasy System构建携带人 TIMP1基因片段的重组腺病毒Ad-TIMP1，用其感染体外培养的人脐静脉内皮细胞CRL-1730，观察该细胞MMP1、MMP9、TIMP1 mRNA的表达变化，探讨TIMP1基因转导对Hcy造成的内皮细胞损伤的保护作用，为基因治疗AS、稳定AS斑块提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统(穿梭质粒pAd-Track-CMV和骨架质粒pAdEasy-1)以及包装细胞系人胚肾细胞(293T)购自北京大学实验室;pUCm-T载体质粒及BJ5183菌株、JM109菌株、DH5α菌株均为本实验室保存;TaqDNA聚合酶为本实验室提取保存，限制性内切酶BgⅢ、NotⅠ和DNA marker购自TakaRa生物工程(大连)有限公司，Pac I购自NEB公司;T4 DNA连接酶、高纯度质粒柱式提取试剂盒和脂质体购自INVITROGEN公司，胎牛血清(FBS)和DMEM高糖培养液购自美国GIBCO公司。

1.2.1 pUC-hTIMP1重组质粒的构建 在Genebank中搜索hTIMP1序列，设计上游引物为5'-AGA ACC CAC CAT GGC CCC CT-3'，下游引物为5'-GAT TCA GGC TAT CTG GGA CCG-3'。从人心肌组织中提取总 RNA，采用 RT-PCR技术得到人 TIMP1 (hTIMP1)的基因片段，将其连接到pUCm-T载体质粒中，转化入感受态JM109细胞，含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆，提取质粒，NcoI酶切鉴定正确后再次转化入JM109进行扩增，测序正确后提取质粒。

1.2.2 穿梭质粒AdTrack-CMV-hTIMP1的构建分别用BgⅢ和NotⅠ双酶切pUC-hTIMP1和穿梭质粒pAdTrack-CMV，用凝胶回收hTIMP1片段和开环质粒pAdTrack-CMV，T4 DNA连接酶连接二者并转化JM109感受态细胞，含卡那霉素的LB培养基筛选阳性克隆，提取质粒，酶切及测序鉴定正确后再次转化JM109感受态细胞扩增，提取质粒，命名为重组质粒AdTrack-CMV-hTIMP1。 1.2.3 细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-GFP-hTIMP1 电穿孔法(2 500 V，5 ms)将PemI酶切线性化的1 μg的AdTrack-CMV-hTIMP1重组质粒和1 μg的pAdTrack-CMV(空载体阴性对照)分别转化到含有pAdEasy-1的电感受态大肠杆菌BJ5183中，通过卡那霉素LB培养基平板筛选(50 μg/mL)获得阳性腺病毒重组质粒，BamHⅠ和PacⅠ酶切鉴定，PCR进一步鉴定。选取重组正确的质粒(Ad-hTIMP1和Ad-Track)在DH5α菌中扩增，高纯度质粒柱式提取试剂盒提取质粒，Pac I酶切线性化后凝胶回收较大片段，冰乙醇沉淀，溶于无菌水中待用。

1.3 重组腺病毒在293T细胞中的包装和扩增

1.3.1 重组腺病毒质粒转染293T细胞并包装 采用阳离子脂质体法。用脂质体Lipofectamine 2000及Plus reagent将4μg的 pAd-hTIMP1和4μg的pAd-Track转染到2个60 mm培养皿中(细胞融合度为50%～60%)进行病毒包装，24 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，倒置相差显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。于转染后第9天收集细胞，反复冻融法得到重组腺病毒Ad-hTIMP1和Ad-Track上清。

1.3.2 包装好的重组腺病毒感染293T细胞并扩增

取病毒上清的1/3感染293T细胞(约90%融合)，感染后第3天反复冻融法收集重组腺病毒上清，反复感染4次于293T细胞中扩增病毒到所需滴度。

1.3.3 重组腺病毒的纯化 用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒颗粒，用OD260法测定腺病毒的滴度。根据公式(病毒滴度=OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×1012)进行计算。用2%、pH 6.2的磷钨酸溶液对样品进行负染，透射电镜下观察。

1.4 腺病毒介导hTIMP1在内皮细胞中过表达对抗Hcy对内皮细胞刺激的观察

在开始实际的Milk-run设计之前，必须对实施Milk-run的条件进行调整，以确定是否满足了允许在工厂内使用Milk-run生产系统的3个要求：布局、安全和物料。

1.4.1 腺病毒感染细胞 将CRL-1730细胞分到6孔板中(2.4×105/孔)。24 h后，按6个感染复数(MOI)值(30，50，70，90，110，150)进行腺病毒感染，48 h后观察细胞及其荧光表达情况。

1.4.2 细胞分组及处理 根据加入重组腺病毒的不同将CRL-1730细胞分为三组，即空白对照组、Track对照组和基因治疗组。根据以上各组中加入Hcy的剂量不同各分成三个亚组:Hcy 0 mmol/L(空白对照)组，Hcy 0.01 mmol/L(生理浓度)组和Hcy 0.1 mmol/L(病理浓度)组。每个亚组均设8个复孔，Hcy刺激后6 h收集各复孔中的细胞培养液。

1.4.3 CRL-1730细胞MMP1、MMP9及TIMP1基因片段的扩增 采用RT-PCR法，以GAPDH为内参照。用UNIQ-10柱总RNA抽提试剂盒(上海生工)提取各组CRL-1730细胞中的总RNA，逆转录得到cDNA，PCR扩增MMP1、MMP9及TIMP1基因片段(PCR引物设计及实验条件见表1)。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。以电泳条带的灰度代表mRNA含量，目的基因与内参电泳条带的灰度比值反应目的基因的相对值。Gel-pro 3.1凝胶成像系统分析结果。

表1 PCR引物序列及实验条件

1.5 统计学方法 以每亚组的8个样品值中目的基因的mRNA相对值计算均数，数值以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间比较采用LSD检验或Dunnett's t检验(方差不齐时)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞中hTIMP1的扩增结果 扩增后得到637 bp的hTIMP1特异条带。

2.2 AdEasy-GFP-hTIMP1重组质粒PacⅠ酶切鉴定结果 在pAd-Track-CMV上有两个PacⅠ的酶切位点，可将重组子切为一个大片段和一个约4.5 kb的小片段，见图1。

图1 PacⅠ酶切Ad-hTIMP1和Ad-Track重组质粒

2.3 293T细胞中包装并扩增腺病毒结果 重组腺病毒转染293T细胞后，第4～5天荧光显微镜下可观察到GFP呈“彗星状”改变。转染第9天采用反复冻融法收集病毒液，并将之感染293T细胞，第3天可以观察到典型的CPE。反复感染、冻融收集3次后，CsCl密度梯度离心法纯化，OD260法测得重组腺病毒pAd-hTIMP1的滴度为1.9×1012VP/mL，对照重组腺病毒pAd-Track的滴度为0.6×1012VP/ mL。透射电镜下见病毒颗粒直径约90 nm，呈多面体形状，绝大多数病毒颗粒完整。

2.4 腺病毒裂解液hTIMP1的PCR扩增结果 扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳可见 637 bp的hTIMP1特异条带(图2)。

图2 腺病毒裂解液hTIMP1的PCR扩增片段(可见637 bp的特异条带)

2.5 重组腺病毒感染CRL-1730细胞后倒置荧光显微镜下的观察结果 重组腺病毒感染CRL-1730细胞后，倒置荧光显微镜下可见荧光表达强烈，且多数细胞均有荧光表达。

2.6 各组CRL-1730细胞的hTIMP1、MMP1、MMP9 mRNA表达比较 见表2。表2表明，病理剂量Hcy可以刺激CRL-1730细胞的MMP1、MMP9 mRNA表达升高;重组Ad-hTIMP1感染CRL-1730细胞后其hTIMP1 mRNA的高表达可抑制MMP1 mRNA的表达，并可对抗Hcy对CRL-1730细胞的损伤作用; hTIMP1 mRNA过表达对MMP 9的转录有一定的抑制作用。

3 讨论

AS斑块局部ECM降解增加而合成减少等因素增加了斑块的易损性，从而诱发急性冠脉综合征的发生。因此，如何降低AS斑块的易损性，防止AS斑块的破裂是当前AS防治研究的新方向。

表2 各组CRL-1730细胞的hTIMP1、MMP1、MMP9 mRNA表达比较(±s)

表2 各组CRL-1730细胞的hTIMP1、MMP1、MMP9 mRNA表达比较(±s)

注:与空白对照组相比，*P＜0.05;与0 mmol/L浓度组相比，△P＜0.05

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研究表明，AS斑块损伤部位MMPs表达升高，包括间质胶原酶(即MMP1)、明胶酶(即MMP2和MMP9)以及基质降解酶(即MMP3)，而TIMP1和TIMP2等表达减少。Johoson等［4］在冠状动脉的AS斑块中检测发现MMPs与TIMPs的比例失调，认为调节两者之间的比例可起到治疗AS的作用。Rouis等［5］报道，腺病毒介导 TIMP1过表达可以减轻ApoE-/-小鼠的颈动脉AS损伤程度，并推测此作用是由于TIMP1抑制MMPs活性，保护了ECM，进而抑制了平滑肌细胞的移行所致。该研究中，小鼠喂食6周高胆固醇食物后注射携带TIMP1的重组腺病毒，4周后AS斑块的损伤面积明显减小，与之前研究转基因过表达TIMP1抑制MMPs表达的结果相一致［6］。另外，感染携带TIMP1的重组腺病毒(Ad.TIMP1)使猪主动脉内皮细胞过表达TIMP1，可以减少细胞移行及对ECM的侵袭［7］。利用分子生物学技术使局部TIMPs过表达，为治疗AS带来了希望［8］。

已知遗传性高Hcy血症与早发AS有关，其机制可能与Hcy损伤血管内皮细胞，诱使平滑肌细胞肥大、增生及移行，促进ECM特别是胶原的降解等作用有关。研究［9］表明，高Hcy血症患者外周血单核细胞中MMP9 mRNA水平升高，表明Hcy可以通过调节MMPs的活性而导致AS。有报道ApoE缺失的小鼠高Hcy血症可增加AS面积，升高MMP9的表达，表明Hcy可以改变血管壁ECM的稳态。而腺病毒介导局部过表达TIMP1对不同浓度Hcy刺激的内皮细胞是否有保护作用目前未见报道。

本研究发现，病理浓度Hcy可以刺激人脐静脉内皮细胞中MMP1、MMP9 mRNA的表达增加，使MMPs/TIMP1升高，二者比例失衡。表明Hcy可以通过影响MMPs的表达，增加ECM的降解，这与之前的研究是一致的［10］。另外，重组Ad-hTIMP1感染内皮细胞后细胞内TIMP1 mRNA表达明显升高，即使在病理剂量Hcy刺激下，TIMP1 mRNA的表达仍处于高水平，说明外源性TIMP1可对抗Hcy的抑制作用。病理浓度Hcy可刺激CRL-1730细胞MMP1、MMP9 mRNA的表达增加。感染了 Ad-TIMP1的CRL-1730细胞在受到病理浓度Hcy刺激时MMP1、 MMP9 mRNA表达均减低，说明TIMP1 mRNA过表达对MMPs的表达有一定的抑制作用，从而对抗Hcy对内皮细胞的损伤作用，这为TIMP1作为靶基因用于稳定动脉粥样斑块的基因治疗奠定了基础。

目前，TIMP1的作用机理尚不完全清楚，有人推测可能通过其第17～19位上的亮氨酸—颉氨酸—异亮氨酸与MMP1的S1'-S2'-S3'区结合，使MMP1第16位上天冬氨酸残基的羧基作用于其活性中心的锌，从而抑制其活性。本研究发现，TIMP1mRNA过表达降低了MMP1、MMP9 mRNA水平。表明TIMPs过表达可能对MMPs的转录有抑制作用，但其机理尚需进一步研究。

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