山东地区汉族骨髓捐献者HLA-DRB1基因分型及多态性分析

申 华，庄云龙，王 静，林 明，孙桂芝，乔文本

(山东省血液中心，济南250014)

人白细胞抗原(HLA)位于6号染色体短臂区域，是由一组紧密连锁的基因座所组成的具有高度多态性的遗传复合体。HLA是人类重要的遗传标志，在抗原识别、呈递、T细胞分化与活化、调节免疫细胞相互作用等方面起着非常重要的作用，也是影响造血干细胞和器官移植成败及长期存活的关键因素之一。由α和β链组成的HLA-DR分子是细胞表面的糖蛋白，是HLA二类分子的一种。目前发现DRB1等位基因有1 094个，具有丰富的多态性。DR分子主要存在于B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞以及活化T淋巴细胞等免疫细胞上，它能够结合抗原肽并且将自身和非己抗原递呈给CD+4T细胞，在抑制和调节免疫反应中起着至关重要的作用。HLA-DR分子不仅与供、受体配型有关，而且其不同等位基因与自身免疫性疾病、炎症和感染性疾病的发生密切相关［1～4］。2010年7月28日～10月26日，我们采用聚合酶链反应—测序为基础的分型方法(PCR-SBT)，对909例山东地区汉族骨髓志愿捐献者进行了 HLA-DRB1基因分型，分析其HLA-DRB1等位基因的多态性及其分布特点，以便于为需要接受器官移植者寻找合适供者，也为后续进行HLA-DRB1基因多态性与疾病发生的相关性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 自中华骨髓库山东分库内随机选取909例山东汉族骨髓志愿捐献者(男460例、女449例，年龄23～45岁)的EDTA抗凝全血。

1.2 HLA-DRB1等位基因检测方法 利用EZ Bead system-32 DNA提取工作站提取山东汉族骨髓志愿捐献者血液的DNA并测定260、280 nm处的光密度值(OD260、OD280值)，调整DNA浓度。以提取的DNA为模板(终浓度2 ng)，加Taq酶(0.0375 U)和包含引物(1 μM)等混合物共10 μL。用PCR反应体系扩增HLA-DRB1基因的外显子和内含子序列。PCR扩增反应参数:96℃ 2 min，1个循环; 96℃30 s，65℃ 30 s，5个循环;72℃ 120 s，96℃30 s，62℃ 30 s，35个循环;72℃ 120 s，10℃ 4 h。反应结束后取2.5 μL扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶上进行检验。参照琼脂糖凝胶电泳结果中的阳性条带，在相应PCR扩增产物的EP管内加入Fast AP(1 U/μL)0.8 μL和Exonuclease I(20 U/μL) 0.2 μL，混匀后于PCR仪中37℃ 15 min、85℃ 15 min。依照电泳图稀释PCR产物后将各位点PCR产物1 μL分别转移到标记好的扩增板对应位置，取380 μL(配100个 PCR混合物)各种 Sequencing Primer Mix，分别置于16个1.5 mL洁净的离心管内，再分别加入20 μL的BigDye，混匀后取各混合物4 μL，加入到对应扩增板孔，共5 μL的PCR反应体系，双向单链扩增HLA-DRB1基因的2/3外显子。Sequencing PCR反应参数为96℃ 1 min，1个循环; 96℃100 s，60℃120 s，40个循环;10℃4 h。扩增结束后，向每孔中加入125 mM的EDTA 2.5 μL，混匀后，加入15 μL无水乙醇，再充分混匀，室温避光10 min。2 250 g离心30 min。将扩增板倒置于吸水纸上，180 g离心1 min。70%乙醇洗涤干燥后，向每孔中加入10 μL甲酰胺，置3730测序仪上检测。测序后导出的结果用专用软件分析，依据的HLA数据库版本为08/13/10。观察HLA-DRB1的基因频率以及比较不同国家和地区人群HLA-DRB1等位基因分布。

1.3 统计学方法 用直接计数法得到HLA-DRB1等位基因的观察数，并计算各等位基因频率。不同人群间HLA-DRB1等位基因频率分布比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山东地区汉族骨髓志愿捐献者HLA-DRB1等位基因频率 909例山东地区汉族骨髓志愿捐献者共检出42种HLA-DRB1等位基因，其频率及血清学组特异性见表 1。其中，HLA-DRB1*0901 (16.28%)、HLA-DRB1*1501(15.13%)和HLADRB1*0701(14.04%)基因频率较高，基因频率较低的位点分别是HLA-DRB1*0408、HLA-DRB1* 0809、HLA-DRB1*1103、HLA-DRB1*1303、HLADRB1*1412、HLA-DRB1*1425和HLA-DRB1* 1601，各占0.06%。

2.2 山东地区汉族骨髓志愿捐献者与其他地区、种族人群的HLA-DRB1等位基因频率比较 山东汉族骨髓志愿捐献者 HLA-DRB1*0901的频率(16.28%)与新疆维吾尔族(1.92%)［5］、韩国人(9.18%)［6］和德国人(0.97%)［7］相比，P均 ＜0.05。山东骨髓志愿捐献者的HLA-DRB1*1501的频率(15.13%)与江苏(10.79%)［8］、湖北(9.97%)［9］、广东汉族(8.33%)［10］，新疆维吾尔族(8.65%)、韩国人(7.42%)和日本人(8.90%)［9］相比，P均 ＜0.05。山东骨髓志愿捐献者 HLADRB1*0701的频率(14.04%)与湖北汉族(0)、广东汉族(4.17%)、韩国人(7.22%)和日本人(2.30%)相比，P均＜0.05。

3 讨论

HLA的分型方法经历了血清学分型、细胞学分型和基因分型。前两种方法由于技术上的缺陷，存在操作复杂、分型不准确的缺点，已经逐渐被淘汰。基因分型方法又经历了PCR序列特异性引物(PCRSSP)、PCR序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)、基因芯片和PCR-SBT等。PCR-SSP和PCR-SSOP对新近发现的等位基因无法得出准确结果。PCR-SBT直接对HLA基因的DNA进行测序分析，具有分型准确、分辨率高的特点，可以确定新的等位基因，成为HLA分型的金标准，是目前最先进的测序分型技术。本研究利用该技术对909例山东汉族骨髓志愿捐献者的HLA-DRB1位点进行高分辨分型，共检出HLA-DRB1等位基因42种，其中分布频率位于前6位的等位基因(HLA-DRB1*0901、1501、0701、1202、0803、1101)累计频率为66.07%，表明山东汉族人群中虽然HLA-DRB1多态性较为丰富，但常见等位基因的分布仍比较集中，携带这些常见等位基因的器官移植受者较易找到与之相配的供者。器官移植及造血干细胞移植成功的关键在于找到与HLA高分辨分型相配合的供者［11］。研究［12］表明，HLA-DRB1等位基因不同与非亲缘性脐血移植时移植物抗宿主病(GVHD)发生率之间存在显著相关性，而且DRB1不相合与受体存活期缩短密切相关。在非亲缘性脐血移植HLA分型中，对HLA-DRB1位点高分辨分型技术的应用可以显著降低受体GVHD的发生率［13］。由此可见，HLA-DRB1等位基因高分辨准确分型对于器官移植、组织配型、GVHD的预防等有重要意义。

表1 909例山东汉族骨髓志愿捐献者HLA-DRB1的等位基因频率及血清学组特异性

山东汉族人群HLA-DRB1等位基因频率分布与江苏、湖南、广东汉族、新疆维吾尔族、韩国人、日本人以及德国人相比有明显差异，但差异程度不同，如与江苏汉族人相比，HLA-DRB1等位基因频率排在前3位的相同(HLA-DRB1*0901、1501、0701);而与韩国人相比，HLA-DRB1等位基因频率排在前3位的只有1个相同(HLA-DRB1*0901)。HLADRB1具有高度多态性，不同种族、民族、地域的人有一定的相关性，但又有各自的特点。这对追溯中华民族的源和流及民族间的血缘遗传关系具有重要意义。

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