重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

刘 伟，余英豪

（中国人民解放军南京军区福州总医院病理科，福州 350025）

人体的抗肿瘤免疫反应主要是由激活的T淋巴细胞介导，T细胞激活需要双信号系统，第一信号是由T细胞受体（TCR）与抗原肽-MHC复合物相结合所提供，第二信号是由辅助分子或共刺激分子通过与T细胞上相应受体结合而传递的，其中以B7分子的共刺激作用最为重要，而肿瘤细胞表面往往缺乏或低表达B7分子，是肿瘤细胞逃避宿主免疫系统监视和灭杀的重要机制之一［1］。因此，通过转基因使肿瘤细胞表达 B7分子，为 T淋巴细胞激活提供第二信号，从而激活T细胞发挥抗肿瘤效应。MIP-1α类属 CC趋化因子，与其相应受体结合后诱导趋化T细胞、单核细胞、树突状细胞、NK细胞等免疫细胞，募集到肿瘤局部，产生抗肿瘤效应［2，3］。

从理论上推测，趋化因子 MIP-1α和共刺激分子B7-1基因转染淋巴瘤细胞后，机体抗淋巴瘤免疫作用可能会明显增强。为此，本研究拟建立重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体，为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 慢病毒载体：慢病毒载体pGC-FU Vector购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.1.2 菌株来源：大肠杆菌 DH5α由本实验室保存。

1.1.3 细胞株：293T细胞，由本实验室保存。

1.1.4 主要试剂：1 kp DNA ladder Marker，250 bp DNA ladder Marker（Fermentas公司）；AgeI，（NEB公司）；In-Fusion kit（BD 公 司）；Taq polymerase （SinoBio公司）；Plasm id抽提Kit（Promega公司）；一抗 Mouse Anti-GFP，二抗 Goat Anti-Mouse（Santa-Cruz公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；MMLV逆转录酶（PROMEGA公司）。

1.1.5 主要仪器和器材：PCR 仪（Applied Biosystems公司）；稳压DNA电泳仪（BioRad公司）； SDS-PAGE蛋白电泳仪，蛋白转膜仪（上海天能公司）；5417R台式冷冻高速离心机（Eppendorf公司）；阳性克隆测序在上海美季生物技术公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MIP-1α和 B7-1基因重组慢病毒载体的构建：

（1）慢病毒载体酶切 使用 AgeI进行酶切消化，50μL反应体系，含 ddH2O 42μL，10×buffer 5μL，纯化的 DNA质粒（1 ug/μL）2μL，AgeI （5 U/μL）1μL，将上述混合的反应物置37℃ 2 h。

（2）目的基因片段获取 从 GeneBank中查寻小鼠MIP-1α和B7-1基因序列，设计引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

①引物合成 设计B7-1和 MIP-1α基因引物（表1）

②PCR扩增目的基因 分别以 Primer（+）： MIP-1α-AgeI-F，Primer（-）：MIP-1α-AgeI-R 和Primer（+）：B7-1-AgeI-F，Primer（-）：B7-1-AgeI-R为引物，进行目的基因 MIP-1α和 B7-1的 PCR扩增。反应体系为20μL，目的基因M IP-1α的PCR反应循环条件：94℃ 5 min→（94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s）30循环→72℃ 10 m in→4℃ +∞；目的基因B7-1的PCR反应循环条件：94℃ 5 min→（94℃30 s→55℃ 30 s→72℃ 1 m in）30循环→72℃ 10 min→4℃+∞。

（3）重组克隆制备

①感受态制备 用氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞，并分装置-70℃冻存。

②PCR产物交换进入线性化慢病毒载体（表2）。

表1 B7-1和MIP-1α基因引物Tab.1 The primers of B7-1 and MIP-1 gene

表2 PCR产物反应体系Tab.2 PCR reaction system

于25℃ 反应30 min，再于42℃ 反应15 min，制备克隆交换液，准备转化。阳性对照和自连对照，加入的载体和连接组一致，但阳性对照加入的纯化PCR产物为GAPDH基因（同样带有交换臂）。

③转化按说明进行转化感受态细胞并转移到Amp抗性（100 ug/m L）的LB琼脂培养基上，长出的克隆进行后续PCR鉴定。

（4）阳性克隆的PCR鉴定 在长出的克隆菌表面沾一下，溶于10μL LB，混匀后取1μL作为菌落PCR模板；分别以 PCR引物：Primer（+）：Ubi-F； Primer（-）：EGFP-N-R进行 PCR扩增。PCR反应体系为20μL。目的基因MIP-1α的PCR条件：94℃2 min→94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 30 s）30循环→72℃ 6 min→4℃ +∞。目的基因 B7-1的 PCR条件：94℃ 2 min→（94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 1 m in）30循环→72℃ 6 min→4℃ +∞。设阴性对照，自连对照，阳性对照。

1.2.2 Western blot检测目的基因质粒表达：

重组 MIP-1α和 B7-1目的基因质粒分别转染293T细胞，24 h后观察荧光表达情况，收集转染成功的细胞，加入细胞裂解液裂解抽提蛋白，按照Western blot实验技术操作说明分别进行检测，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭，加入一抗Mouse Anti-GFP，二抗Goat Anti-Mouse，进行杂交、洗膜等操作后，曝光、显影定影。

1.2.3 重组慢病毒载体的包装及滴度测定：

（1）慢病毒的包装 重组慢病毒pGC-LV载体，pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体组成的三质粒系统共转染293T细胞，按照 Lipofectam ine 2000的说明书操作。收集转染后48 h的293T细胞上清液，离心浓缩后分装在病毒管中，-80℃长期保存。取其中一支行病毒滴度测定。

（2）实时荧光定量PCR法测定慢病毒滴度

①样品制备 检测前1天，对293T细胞传代，每个24孔中加1×105个细胞。次日，准备7～10个无菌的 Ep管，在每个管中加入 90μL培养基（DMEM+10％FBS）。取待测病毒原液10μL加入到第一管中，混匀后，取10μL加入到第二管中。继续相同的操作直到最后一管。第1个Ep管中加入10 uL病毒原液，记为1E+1μL；第二个 Ep管中进行了第1次10倍稀释，所得病毒原液为第1个 Ep中的1/10，记为1E+0μL；依次类推…，第7个Ep管中进行了第6次10倍稀释，所得病毒原液为第6个Ep中的1/10，记为1E-5μL。

②总 RNA 抽提 根据 Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行，均为RNase-free操作。紫外分析测定所抽提RNA的浓度。

③RNA逆转录获cDNA 目的基因GFP：上游引物：5＇-TGCTTCAGCCGCTACCC-3＇，下游引物：5＇-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3＇；ACTIN基因：上游引物：5＇-GTGGACATCCGCAAAGAC-3＇，下游引物： 5＇-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3＇。

按Promega公司的M-MLV操作说明书进行，均为RNase-free操作。RT反应体系11μL，得到的RT反应产物cDNA立即用于PCR，部分保存在-80℃冰箱中。

④实时荧光定量PCR检测 Real-time PCR在Bio-rad的iQ5上完成。总反应体系20μL，设定程序为两步法Real-Time定量：预变性95℃ 15 s，之后每一步变性95℃ 5 s，退火延伸60℃ 30 s，共40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。制作熔解曲线：PCR结束后，再95℃变性1 m in，冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加 0.5℃，保持 30 s，同时读取吸光值。

2 结果

2.1 慢病毒载体pGC-FUVector酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱（图1）。

图1 慢病毒载体pGC-FU Vector酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 The agarose gel electrophoresis result of Lentiviral vector pGC-FU

2.2 目的基因 MIP-1α和B7-1PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱（图2）。

2.3 阳性克隆的PCR鉴定

（1）MIP-1α阳性转化子得到483 bp的条带，阴性转化子得到198 bp的条带，初步表明 MIP-1α基因重组慢病毒载体构建成功（图3）。

（2）B7-1阳性转化子得到1125 bp的条带，阴性转化子得到198 bp的条带，初步表明 B7-1基因重组慢病毒载体构建成功（图4）。

2.4 阳性克隆测序结果及结果分析

接种阳性转化子，37℃ 培养16 h保存为甘油菌，分别分装200μL送上海美季生物技术有限公司进行双向序列测序，比对分析证实，MIP-1α和B7-1基因测序结果与目标序列完全一致。

2.5 重组 MIP-1α和 B7-1目的基因质粒转染293T细胞，48h后的荧光蛋白表达情况（彩插4图5～6）。

2.6 WesternBlot检测结果

Western blot检测结果显示 MIP-1α基因融合GFP和B7-1基因融合 GFP在293T细胞中都获得表达（彩插4图7～8）。

图2 目的基因MIP-1α和B7-1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.2 The agarose gel electrophoresis results of targetsegments of M IP-1αand B7-1 gene

图3 MIP-1α转化子的PCR扩增产物电泳结果图Fig.3 The electrophoresis results of target segment of M IP-1αgene

2.7 重组MIP-1α慢病毒滴度测定

（1）实时定量PCR曲线图（图9）

（2）不同浓度病毒感染后样品组的 Ct值及表达量分析（表3）

加入不同病毒量的细胞样品，通过比较control

图4 B7-1转化子的PCR扩增产物电泳结果图Fig.4 The electrophoresis results of target segment of B7-1 gene

图9 加入不同重组M IP-1α慢病毒量的细胞样品随着PCR循环的增加，荧光值开始上升，经过40个循环后均达到峰值Fig.9 Fluorescence curve in different M IP-1αgene groups gradually rose with the PCR process and reached the peak after 40 cycles

表3 病毒感染后样品组的Ct值及表达量Tab.3 The Ct values of different groups infected with virus

组和试验组的Ct值差异判断滴度值。判断标准为Ct值差异 ＞2即存在显著差异。反转录反应所获得的20μLcDNA中只取了1μL用于实时定量检测，该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。

在本次滴度检测中，1E-4μL组样品和 control组样品的差值，即△CtCon-△Ct样品组=2.075＞2，说明1E-4μL组与control组样品的Ct值存在显著差异，证实1E-4μL组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1/ （1E-4）*20=2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/m L。

（3）目的基因及 Actin基因的熔解曲线（图10）。

2.8 重组B7-1慢病毒滴度测定

（1）实时定量PCR曲线图（图11）。

图10 Actin基因和目的基因的熔解曲线Fig.10 The melting curve of actin gene and target gene

图11 加入不同重组B7-1慢病毒量的细胞样品随着PCR循环的增加，荧光值开始上升，经过40个循环后均达到峰值Fig.11 Fluorescence curve in different B7-1 gene groups gradually rose with the PCR process and reached the peak after 40 cycles

（2）不同浓度病毒感染后样品组的 Ct值及表达量分析（表4）

在本次滴度检测中，1E-4μL组样品和1E-5 μL组样品的 Ct值，即△Ct1E-4μl组-△Ct1E-5μl组= 22.27-19.695=2.575＞2，说明 1E-04μL组与1E-5μL组样品的 Ct值存在显著差异，病毒滴度为：1/（1E-4）*20=2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/m L。

（3）目的基因及Actin基因的熔解曲线

①Actin基因的熔解曲线（图12）。

表4 病毒感染后样品组的Ct值及表达量Tab.4 The Ct values of different groups infected with virus

3 讨论

肿瘤基因治疗的关键是载体的选择，用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等，但是这些载体均存在不足之处，严重影响了基因治疗的有效性及安全性。慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，能够整合到宿主细胞的基因组中，可以在体内长期稳定表达，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点［4］。本研究所用的 Lentivirus为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒，但该病毒仍然具有潜在的生物学危险［5，6］。目前，慢病毒载体已被应用于帕金森氏病、镰状细胞贫血、血友病、肝癌及结直肠癌等疾病的研究［7-11］。

图12 Actin基因和目的基因的熔解曲线Fig.12 The melting curve of actin gene and target gene

本研究中，我们自行设计引物合成和PCR扩增目的基因后，将目的基因与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接，其产物转化细菌感受态细胞，对长出的阳性克隆进行PCR鉴定及直接测序比对分析，证实测序结果与目标基因序列完全一致，表明B7-1和 MIP-1α基因重组慢病毒载体构建成功。B7-1目的基因质粒转染293T细胞，48 h后，在荧光显微镜下能够观察到＞90％的293T细胞中有强荧光表达；然而为何MIP-1α目的基因质粒转染293T细胞后，只观察到部分细胞中有荧光表达呢?这是因为小鼠MIP-1α蛋白是分泌蛋白［12］，表达后分泌到胞外，在细胞内不能逐渐蓄积所含 M IP-1α蛋白量较少，故仅观察到部分细胞有荧光蛋白表达。Western Blot检测到目的基因 B7-1和 MIP-1α融合GFP的表达，进一步证实了目的基因重组载体在293T细胞中的表达。

目前常用的测定慢病毒滴度的方法有孔稀释法和实时荧光定量PCR，孔稀释法是根据目的基因质粒转染293T细胞后的荧光表达情况计算病毒的滴度，由于荧光蛋白的表达程度易受到插入的目的基因片段的影响，从而导致该方法不能准确反映病毒的滴度，从而其应用受到限制。另外，如果目的基因表达的蛋白为分泌蛋白，因转录翻译生成的蛋白不能在细胞的胞浆或包膜中蓄积，导致观察不到或仅观察到较弱的荧光表达，应用孔稀释法就难以准确测定病毒滴度。实时荧光定量PCR法检测病毒基因组RNA的拷贝数，不受目的基因转录翻译生成的蛋白类型和蛋白表达量的影响，既能检测蛋白表达定位于胞浆及胞膜的目的基因，也能检测到表达分泌蛋白的目的基因，此方法简便易行、灵敏度高、特异性好；本研究采用实时荧光定量PCR法检测到B7-1和MIP-1α基因重组慢病毒载体的滴度均达到2.00E+8 TU/m L；虽然其能够比较准确的反映慢病毒载体的整合情况，但不能准确反应目的蛋白的实际表达情况［13，14］，其原因可能是由于病毒载体整合入靶细胞异染色质中，使目的蛋白表达受到影响。

在应用实时荧光定量PCR检测重组慢病毒载体滴度的过程中，由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析实时荧光定量PCR定量结果。由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）为熔解峰值。本研究的熔解曲线图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增，B7-1和MIP-1α基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/m L。

B7-1和MIP-1α基因重组慢病毒载体的成功构建，为后续淋巴瘤基因治疗奠定了基础。

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