肝素通过TLR4减少脂多糖刺激的人内皮细胞IL－8表达*

李 旭， 李 鑫， 马晓春

(中国医科大学附属第一医院重症医学科，辽宁沈阳110001)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞壁外膜的一种成分，是导致脓毒症的主要因素［1］。LPS从细菌细胞膜脱落，与脂多糖连接蛋白(lipopolysaccharide－binding protein，LBP)相结合，连接到可溶型或膜型白细胞分化抗原(cluste of differentiation，CD)14，从而将其转运至 LPS/Toll样受体4(Toll－like receptor 4，TLR4)复合物，导致炎症介质的产生，如肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－ α)，白细胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)、IL－6和IL－8，进而发生一系列炎症反应［2］。IL－8是一种典型的趋化因子，属于CXC类趋化性细胞因子家族，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，成纤维细胞、上皮细胞、树突细胞和内皮细胞等也可以产生［3］。IL－8的主要功能是在炎症过程中促进中性粒细胞的募集、游走、趋化至炎症部位，释放多种炎症介质，引起炎症反应和组织损伤，在脓毒症过程中发挥重要作用［3］。近年来越来越多的研究表明内皮细胞在LPS引起的脓毒症多器官功能障碍等病理过程中起到关键作用［4］。内皮细胞是机体的主要炎症反应细胞，亦是LPS作用的靶细胞，它们衬覆于血管内壁构成血管通透性的主要屏障，能合成和分泌调节凝血－纤溶系统的物质，调节血管张力的因子以及细胞因子等，从而在创伤愈合及炎症反应中起到重要作用［5］。肝素(普通肝素，或称未分级肝素，unfractionated heparin，UFH)在临床应用中降低脓毒症患者发生弥散性血管内凝血、急性肾衰竭和多器官功能障碍的比率，并降低28 d病死率［6］，但具体机制并不清楚，因此，本研究旨在探讨肝素对脂多糖刺激人内皮细胞IL－8水平的影响，并研究TLR4可能的影响，寻求肝素在临床脓毒症患者中应用的理论依据。

材料和方法

1 材料

人肺微血管内皮细胞株(HPMECs)购自上海拜力生物技术有限公司;胎牛血清(HyClone);DMEM培养基(HyClone);LPS(O55∶B5，Sigma);Trizol(Invitrogen);TaKaRa 反转录试剂盒(大连宝生物工程公司);人 IL－8 ELISA试剂盒购于R＆D。其余均为国产分析纯试剂。

2 方法

2.1 细胞培养 HPMECs细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，每隔1～2 d换液1次。

2.2 细胞处理及分组 按照1×109cells/L密度将HPMECs接种于6孔板，每孔2 mL。实验分为4组:正常对照组、LPS刺激组、LPS+普通肝素100 U/L组和LPS+普通肝素103U/L组。肝素作用组提前15 min应用既定浓度肝素，后加入10 mg/L浓度的LPS刺激;正常对照组应用相同剂量PBS。各组分别在培养2、6和12 h后收集细胞上清，测定上清中IL－8水平。于2、6和12 h收集细胞提取RNA，于－80℃保存。

2.3 细胞上清中IL－8水平测定 各组细胞分别在LPS作用2、6和12 h收集细胞上清，4 000 r/min离心20 min去除细胞碎屑，应用ELISA方法分析上清中IL－8的表达。操作严格按照试剂盒说明书进行，每组样本作3个复孔。

2.4 IL－8、CD14和 TLR4 mRNA表达测定 应用 Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度。应用反转录试剂盒进行反转录。采用real－time PCR测定。反应总体积:25 μL，加入 cDNA 2 μL。IL －8:上游引物 5’－CAC CGG AAG GAA CCA TCT CA －3’，下游引物5’－AGA GCC ACG GCC AGC TT －3’，各 1 μL，反应条件:95 ℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个扩增循环。CD14:上游引物5’－CCC TAG CGC TCC GAG ATG －3’，下游引物 5’－GAA CGA CAG ATT GAG GGA GTT CA －3’，各1 μL，反应条件:95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，52 ℃ 45 s，35 个扩增循环。TLR4:上游引物CCG AAG CCT TGG CGT TCT，下游引物 TCC CGG TAG TAC AGG CAG ATG，各1 μL，反应条件:94 ℃ 50 s，94 ℃ 5 s，72℃ 50 s，30个扩增循环。选取 β－actin作为内参照，IL －8、CD14 和 TLR4 mRNA 的相对表达量采用 2－ΔΔCt计算。

3 统计学处理

结 果

1 肝素对IL－8蛋白水平的影响

脂多糖刺激后IL－8蛋白表达明显增加，随着时间的延续逐渐上调，12 h达到高峰，肝素减少IL－8蛋白的表达，见图1。

Figure 1.Effect of unfractionated heparin(UFH)on the expression of IL－8 protein induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.图1 肝素对LPS刺激的HPMECs IL－8蛋白水平的影响

2 肝素对IL－8 mRNA水平的影响

脂多糖刺激后2 h IL－8 mRNA表达增高，随着时间的延续逐渐上调，在6 h达到高峰，肝素减少IL－8 mRNA的表达，见图2。F

igure 2.Effect of UFH on the expression of IL－8 mRNA induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.图2 肝素对LPS刺激的HPMECs IL－8 mRNA水平的影响

3 肝素对TLR4 mRNA水平的影响

脂多糖刺激后2 h TLR4 mRNA表达增高，随着时间的延续逐渐上调，在6 h达到高峰，肝素减少TLR4 mRNA的表达，见图3。

Figure 3.Effect of UFH on the expression of TLR－4 mRNA induced by LPS in HPMECs.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs LPS group.图3 肝素对LPS刺激的HPMECs TLR4 mRNA水平的影响

4 肝素对CD14 mRNA水平的影响

脂多糖刺激后没有检测到CD14 mRNA的表达。

讨 论

TLR4是目前最为广泛研究的TLR家族成员之一，迄今为止在人类共鉴定出了11种TLR(TLR1～TLR11)，不同的TLR识别不同的配体，TLR4识别革兰氏阴性菌的 LPS［7］。CD14是锚定在单核细胞、巨噬细胞和多形核白细胞细胞膜表面的一种糖蛋白，分子量55 kD，其主要作为革兰氏阴性菌的LPS高亲和受体，介导细胞识别并捕获LPS，同时将信号向细胞内转导，激活细胞应答，在机体免疫、防御系统引起的一系列病理反应中起关键作用［8］。CD14以2种方式存在，膜型CD14(membrane－bound CD14，mCD14)和可溶型CD14(soluble CD14，sCD14)，其中sCD14主要存在于血清和尿液中［9］。通常认为mCD14主要表达于单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等骨髓细胞，非骨髓细胞则通过上清液中sCD14与LPS结合［10］。根据目前的研究，LPS可通过2条途径激活损伤的血管内皮细胞:一条途径是LPS与血清中的LBP和sCD14结合，再通过内皮细胞上TLR4－MD－2复合物将LPS信号转导至胞内，直接激活内皮细胞;另一条途径是LPS先激活单核细胞、T细胞等免疫活性细胞，使其释放TNF－α、IL－1β等细胞因子，间接激活血管内皮细胞［11］。本研究中，应用胎牛血清培养内皮细胞，其中含有sCD14，加入LPS刺激后，内皮细胞产生TLR4增加，并促进IL－8的表达，说明LPS通过TLR4信号途径促进内皮细胞发生炎症反应，与前期研究结果相一致。

肝素是一种天然形成的氨基葡聚糖，作为一种有效的抗凝剂在临床应用已超过半个世纪的时间。肝素的抗凝作用得到大家的公认，近年来，一系列临床和基础研究表明肝素还可以通过多种途径调节炎症反应。肝素抑制促炎因子的释放，包括 IL －1β、IL －6和 TNF － α［12］。肝素抑制缺血再灌注损伤中NF－κB介导的炎症反应，并通过增加一氧化氮和前列环素的生成减少了内皮细胞功能障碍［13］。在高动力性脓毒症中，肝素改善内皮细胞功能和血管反应性［14］。肝素减少了内毒素鼠TNF－α和IL－1β的表达，降低中性粒细胞集聚，减少肝血管中微血栓形成和纤维蛋白(原)沉积，并降低死亡率［15］。本研究中肝素减少了LPS刺激下内皮细胞IL－8的mRNA及蛋白表达，同时减少了TLR4 mRNA的表达，提示肝素可能通过调节TLR4信号途径发挥在脓毒症中的抗炎作用。

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