免疫细胞化学法检测羟基喜树碱对乳腺癌MCF-7细胞的TIMP-3及空泡化作用

蒲锦兰 周 滢

1.四川省剑阁县人民医院药剂科，四川剑阁 628300；2重庆医科大学中医药学院，重庆 400016

免疫细胞化学法检测羟基喜树碱对乳腺癌MCF-7细胞的TIMP-3及空泡化作用

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1.四川省剑阁县人民医院药剂科，四川剑阁 628300；2重庆医科大学中医药学院，重庆 400016

目的探索羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7细胞信号转导相关基因TIMP-3表达，观察羟基喜树碱处理乳腺癌细胞MCF-7细胞形态的改变，从而探讨羟基喜树碱在乳腺癌治疗中的潜在新靶点。 方法 以乳腺癌细胞MCF-7为研究模型，细胞暴露于羟基喜树碱浓度为10、40、80mg/L的培养液中24h，PBS组为对照组。采用免疫组化法检测羟基喜树碱（HCPT）对乳腺癌MCF-7细胞TIMP-3表达特征及细胞形态的变化。 结果 HCPT对TIMP-3诱导表达作用差异不明显，但HCPT处理组细胞呈现明显的空泡化。 结论HCPT可诱导乳腺癌MCF-7细胞空泡化作用。

羟基喜树碱；空泡化；免疫细胞化学法；金属蛋白酶组织抑制剂-3

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%。它的发病常与遗传有关，以及40～60岁、绝经期前后的妇女发病率较高。迄今为止，乳腺癌的病因及其恶性进展的具体机制尚未完全阐明，随着分子生物学的快速发展，从基因角度寻找乳腺癌治疗中的潜在新靶点对改善患者病情具有非常重要的意义。

羟基喜树碱（hydroxycamptothecin，HCPT）是所有天然喜树碱同类物或合成喜树碱中活性最大的天然衍生物，是一种纯天然的抗癌药物[1]，其可通过激活NF-κB诱导人促进乳腺癌Bcap-37细胞凋亡[2]，亦可依赖Caspase3途径促进细胞凋亡[3]。Liu W等[4]发现HCPT可促进p21WAF1/CIP1表达上调，并通过p53依赖/非依赖途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡，达到杀伤癌细胞的目的。TIMP-3则作为MMP的抑制剂之一[5]，故其TIMP-3表达上调有利于抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡[6]。然而，迄今有关羟基喜树碱与人乳癌细胞的作用机制尚不明确，有待进一步的研究和探讨。本实验运用免疫细胞化学法检测羟基喜树碱对乳腺癌乳腺癌MCF-7细胞的影响，探讨羟基喜树碱在乳腺癌治疗中的潜在新靶点，以期为临床治疗乳腺癌提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人乳腺癌细胞株MCF-7，购自重庆医科大学生命科学研究院。HCPT注射液购自吉林省长春天诚药业有限公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、Hepes、二甲基亚砜（DMSO）均购于Gibco公司。Transwell小室购自CORNING公司，Matrigel胶购于BD Biosciences公司，引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞的药物处理 人乳腺癌细胞株MCF-7由重庆医科大学生命科学研究院提供。MCF-7细胞常规培养于RPMI-1640培养基（含10%新生胎牛血清，20mmol/L Hepes，2.0g/L碳酸氢钠，100U/mL青霉素和 100U/mL链霉素），置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，2～3d传代1次。PBS空白对照组加入20μL PBS缓冲液，HCPT诱导组施加TCPT，使其终浓度分别为10、40、80mg/L细胞培养液，显微镜下显色为阴性者阴性对照组。

1.2.2细胞组化检测TIMP-3在细胞中的表达 取MCF-7细胞经消化离心后以5×107个/L的密度接种于预置盖玻片的6孔板中，待细胞贴壁、基本长满盖玻片后，更换无血清培养基饥饿24h，24h后分别向各孔中施加TCPT，使其终浓度分别为10、40、80mg/L，24h后吸出细胞培养液，取出细胞爬片，0.01mol/L PBS冲洗3次，每次3min，用4g/L多聚甲醛固定，每一浓度组制备16张标本。对细胞爬片进行TIMP-3免疫组化SP法染色，染色结果在显微镜下观察并摄影。

1.3 数据统计

采用SAS 8.2统计软件对数据进行分析处理，mRNA相对表达量以均数±标准差表示，组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫细胞组化结果显示，TIMP-3在MCF-7细胞内均有表达，仅从表观上看，HCPT对其诱导表达作用差异不明显，但HCPT处理组细胞呈现明显的空泡化，见图1。

3 讨论

近年来有研究表明，HCPT及其衍生物可通过作用于DNA拓扑异构酶Ⅰ来抑制DNA复制、转录和有丝分裂，达到抗肿瘤作用。HCPT衍生物7-乙基羟基喜树碱可以募集S期细胞，促进吉西他滨（抗肿瘤药物）代谢物的聚集，减少关卡蛋白激酶1的合成，即7-乙基羟基喜树碱有助于肿瘤细胞敏化，促进其他化疗药物的效应[7]。HCPT的抑癌机制的研究深入将有助于进一步对其进行结构改造和临床应用。以往的研究发现，HCPT对乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖起抑制作用。基因表达谱研究发现，HCPT诱导后，共获得了差异表达信号转导相关基因55个，涉及6个信号通路[8]。

本实验利用免疫细胞化学法检测了羟基喜树碱（HCPT）对乳腺癌MCF-7细胞的空泡化作用。HCPT对TIMP-3诱导表达作用差异不明显，但HCPT处理组细胞呈现明显的空泡化，因此，HCPT可诱导乳腺癌MCF-7细胞空泡化作用，希望本研究对寻找羟基喜树碱在乳腺癌治疗中的潜在新靶点有所帮助，并为临床治疗乳腺癌提供新思路。

[1]Ling YH，Tseng MT，Nelson JA.Differentiation induction of human promyelocytic leukemia cells by 10-hydroxycamptothecin，a DNA topoisomerase I inhibitor[J].Differentiation，1991，46（2）：135-141.

[2]叶孟，林蕾，方勇等.Bay117802抑制羟基喜树碱诱导的人乳腺癌Bcap37细胞凋亡[J].中国临床药理学与治疗学，2005，7：755-759.

[3]叶孟，林蕾，方勇.羟基喜树碱依赖Caspase3途径诱导人乳腺癌Bcap37细胞凋亡[J].中国临床药理学与治疗学，2005，10（8）：881-883.

[4]Liu W，Zhang R.Upregulation of p21WAF1/CIP1in human breast cancer cell lines MCF-7and MDA-MB-468undergoing apoptosis induced by natural product anticancer drugs 10-hydroxycamptothecin and camptothecin through p53-dependent and independent pathways[J].Int J Oncol，1998，12（4）：793-804.

[5]Uría JA，Ferrando AA，Velasco G，et al.Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3，a new member of the metalloproteinase inhibitor family.Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3，a new member of the metalloproteinase inhibitor family[J].Cancer Res，1994，54（8）：2091-2094.

[6]Finan KM，Hodge G，Reynolds AM，et al.In vitro susceptibility to the pro-apoptotic effects of TIMP-3gene delivery translates to greater in vivo efficacy versus gene delivery for TIMPs-1or-2[J].Lung Cancer，2006，53（3）：273-284.

[7]Gálvez-Peralta M，Dai NT，Loegering DA，et al.Overcoming S-phase checkpoint-mediated resistance：sequence-dependent synergy of gemcitabine and 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin （SN-38） in human carcinoma cell lines[J].Mol Pharmacol，2008，74（3）：724-735.

[8]周萍，付丽娟.羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7细胞细胞信号转导相关基因信号通路的影响研究[J].西南大学学报：自然科学版，2010，33（4）：83-87.

The detection of the TIMP-3expression and the cellular vaculization induced by HCPT detected with immunocytochemical method

PU Jinlan1ZHOU Ying2▲1.The Pharmacy Department of the People′s Hospital of Jiange County in Sichuan Province,Jiange 628300,China;2.College of Traditional Chinese Medical,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

ObjectiveTo explore the different concentration of HCPT effects on TIMP-3expression in breast tomor cell line MCF-7and the shapes of MCF-7cells were observed in this paper.MethodsMCF-7cell cultures were exposed to HCPT at concentrations of 10,40,80mg/L for 24h.PBS group as control group.Immunocytochemical method was used to measure the TIMP-3expression in breast tomor cell line MCF-7and the shapes of MCF-7cells for each sample.ResultsThe upregulated expression of TIMP-3in the MCF-7cell line could not be obviously induced by different concentration of HCPT,but the obvious presentation of the cellular vaculization could be induced by the cells of the disposed guoup of HCPT.ConclusionThe cellular vaculization for MCF-7cells can be induced by HCPT.

HCPT;Cellular vaculization;Immunocytochemical method;TIMP-3

R392-33

A

1674-4721（2012）09（a）-0007-02

重庆市卫生局中医药科技计划项目（NO：2010-2-66）。

蒲锦兰，主管中药师，主要工作方向是药剂科药房工作及临床药学工作。

▲通讯作者：周滢，博士，副教授。

2012-05-02 本文编辑：林利利）