HPLC法测定猴头菌片中腺苷

顾慧芬， 庄意丽， 张梦玲

(上海市中药研究所，上海201401)

猴头菌片是采用与猴头菌Hericium erinaceus(Bull．)Pers．有效成分相一致的猴头菌菌丝体提取物制成的制剂。具有益气补血、扶正培本、养胃护胃的作用，临床上常用于治疗胃溃疡、十二指肠溃疡及慢性胃炎等，对多种消化道疾病均有较好的疗效［1］。

猴头菌片含多糖、多肽类、氨基酸等物质，具有免疫调节，保护胃肠道等作用。猴头菌丝体中含有较高含有量的腺苷［2-3］。腺苷具有广阔的生理活性，包括镇静、扩血管、抗缺氧［4］及较弱的抗炎、降胆固醇等作用。现用标准主要是以多糖为质量标准，在猴头菌片生产过程中由于辅料的加入干扰多糖含有量的准确性，所以研究腺苷含有量指标［5-6］作为一个复合的分析指标具有较大意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-1100高效液相色谱仪系统，Millipore Milli-Q超纯水制备仪，CQ—6超声波清洗器 (上海沪超超声波仪器有限公司)。

1.2 试药 甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;腺苷对照品 (中国药品生物制品检定所110879-200202);猴头菌片 (由上海雷允上药业有限公司提供，规格:0.26 g/片，批 号:08050102， 08080101， 08120101， 09030701，09070302，09100102，10040802，10050302，10030501)。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱:(5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相为甲醇-0.01%乙酸(9∶91);检测波长为260 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温25℃;进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取恒质量的腺苷对照品适量，置25 mL量瓶中，加15%甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为0.016 mg/mL的腺苷对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取样品约0.5 g，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入15%甲醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，称定质量，用15%甲醇补足减失的质量，3 000 r/min离心5 min，过滤，取续滤液，用微孔滤膜 (0.45 μm)滤过，即得。

2.4 阴性空白样品溶液的制备 称取不含猴头菌菌丝体的阴性空白样品溶液，按照供试品溶液的制备方法制成阴性空白样品溶液。

2.5 系统适用性试验 取腺苷对照品溶液、供试品溶液和阴性空白溶液各10 μL测绘HPLC图谱。结果在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性空白样品在腺苷出峰时间区域没有干扰峰出现，故对腺苷的测定无干扰作用。见图1。

2.6 线性关系的考察 将质量浓度为0.003 2 mg/mL的腺苷标准品溶液，HPLC分别进样2、5、8、10、15、30 μL，以腺苷标准品进样量为横坐标 (x)，以测定的腺苷峰面积积分值为纵坐标 (y)，绘制标准曲线。得回归方程:y=10.3x－1.24，r=0.999。结果表明腺苷在0.006 4～0.096 μg范围内呈现出良好的线性关系。

2.7 精密度试验 精密吸取腺苷对照品10 μL，按2.1项色谱条件，重复进样6次，测定腺苷峰面积，RSD值为1.7%。说明仪器性能良好，符合定量分析的要求。

2.8 稳定性试验 取同一批号供试样品1份，按2.3项供试品溶液的制备方法，制备成供试液，在常温下放置24 h，于0、2、4、6、8、10、24 h分别进样10 μL，测得的峰面积RSD为1.2%，结果表明样品溶液中的腺苷，在24 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批号样品6份，按2.3项供试品溶液的制备方法，制备成供试液，平行测定6次，结果测得峰面积RSD为0.85%(n=6)，说明方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 取已知含有量的供试样品9份，分别加入一定量的腺苷对照品，按2.3项供试品溶液的制备方法，在腺苷的线性范围内分别制成低、中、高3种不同质量浓度的溶液 (每一种质量浓度3份)。分别进样，测定峰面积及标准偏差。结果见表1。

图1 对照品溶液 (A)、供试品溶液(B)和阴性样品溶液 (C)HPLC色谱图

表1 回收率测定结果

2.11 样品的测定 精密称取9批猴头菌片0.5 g，按2.3项供试品溶液的制备方法，制备成供试品溶液。以质量浓度为0.016 mg/mL的腺苷为对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样10 μL，测定腺苷峰面积，计算质量分数。结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

猴头菌片是由固体培养菌丝体经热水浸提，浓缩而制成的片剂。其药效是各组成成分复杂的综合作用，含有多糖、氨基酸等物质，还含有较高含有量的腺苷。本实验研究表明，猴头菌片中含有相当含有量的腺苷。现有文献报道HPLC法测定腺苷方法很多［7-12］，但用于本制剂测定，分离效果不理想。由于腺苷为水溶性物质，且较稳定的特性，本实验采用适当的提取分离方法，用高效液相色谱法测定猴头菌片中腺苷结果较满意。测定结果表明，在9批猴头菌片中，腺苷质量分数为0.148 0～0.209 2 mg/g。本研究方法简便、快速，测定结果准确可靠，且不同批次之间腺苷含量较稳定，可用于猴头菌片的质量控制。

猴头菌片现用标准主要是以多糖为质量标准，在生产过程中由于辅料的加入干扰多糖含有量的准确性，研究猴头菌片腺苷含有量指标与多糖一起成为产品复合式的质量分析指标，对提高产品质量指标及产品质量稳定性具有较大意义，为猴头菌片质量的提高及标准的完善提供依据。

［1］周静安．RP-HPLC测定复方猴头颗粒剂中腺苷的含量［J］．中成药，2005，27(2):213-214．

［2］李洁莉，陆 玲，陈 坤，等．猴头菌及其药物制品腺苷等药效成分分析［J］．中国食用菌，2002，21(3):32-34．

［3］戚雁飞．HPLC测定复方猴头胶囊中腺苷的含量［J］．中成药，2002，24(3):181-183．

［4］王二丽，何荣和．HPLC法测定中药灵芝中腺苷的含量［J］．海峡药学，2009，21(3):46-47．

［5］李祥玲，胡劲松，陈作红．HPLC测定人工蛹虫草及其培养基中虫草素和腺苷含量［J］．湖南师范大学自然科学学报，2010，33(2):107-111．

［6］原 忠，董 焱，朱静娟．HPLC测定北沙参中腺苷的含量［J］．中国中药杂志，2005，30(7):1391-1392．

［7］颜栋林．HPLC法测定冬虫夏草胶囊中腺苷含量［J］．药学实践杂志，2010，28(4):293-295．

［8］陈在敏．HPLC法测定珍珠灵芝胶囊中腺苷的含量［J］．海峡药学，2008，20(1):46-48．

［9］范志华，汤卫华，林 霖．HPLC法测定冬虫夏草发酵菌丝粉中腺苷的含量［J］．现代食品科技，2007，23(7):94-97．

［10］李跃辉，杨永华，张水寒，等．高效液相色谱法测定冬虫夏草超微饮片中腺苷含量［J］．中国医院药学杂志，2005，25(10):985-985．

［11］张朔生，马双成．高效液相色谱法测定至灵胶囊中腺苷的含量［J］．中国药事，2005，19(5):298-299．

［12］俞青芬．HPLC法测定冬虫夏草菌粉及含片中腺苷的含量［J］．广西师范大学学报:自然科学版，2010，28(2):65-68．