不同月份肉豆蔻叶片挥发油成分分析

赵祥升， 黄立标， 欧淑玲， 冯锦东

(中国医学科学院药用植物研究所海南分所，海南万宁571533)

肉豆蔻Myristica fragrans Houtt为肉豆蔻科植物，主要分布于印度尼西亚、马来西亚、西印度群岛、巴西等地，我国海南、云南、广东、台湾等地也有栽培。肉豆蔻种仁为传统中药，性温，味辛、微苦，具有温中行气、涩肠止泻的功效，用于脾胃虚寒、久泻不止、脘腹胀痛、食少呕吐等症，现代药理学研究表明有较强的抗菌消炎、镇痛等功效［1］。气相色谱-质谱联用 (GC-MS)技术是植物挥发性成分研究的常用分析手段［2］，前人对肉豆蔻种仁的挥发油成分的GC-MS分析已有报道，主要成分为:单萜、倍半萜和芳香类物质［3-4］。但有关肉豆蔻叶片挥发油成分的分析，特别是其动态的变化鲜有报道，前期的工作中对肉豆蔻叶片中主要成分的动态变化做了研究［5-6］，叶片中含油量、α-蒎烯、β-蒎烯、4-萜烯醇3种成分不同月份相对含有量有一定的变化。

本实验主要是利用GC-MS联用技术对不同月份肉豆蔻叶片挥发油成分进行检测，定性、定量分析主要成分，考察相对含有量随季节变化的趋势;同时利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004版)软件比较不同月份挥发油的相似度，以期对肉豆蔻叶片的药用价值，开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 Agilent5973-6890气质联用仪;Mili-Q纯水仪，中药粉碎机;无水硫酸钠，乙醚为分析纯;肉豆蔻1986年引种至海南省兴隆南药园，每月分别采雌、雄株叶片适量，由中国医学科学院药用植物研究所海南分所陈伟平研究员鉴定为肉豆蔻Myristica fragrans Houtt的叶片，采样时间见表1。

表1 采样时间Tab.1 Sampling time

1.2 方法

1.2.1 挥发油的提取与样品制备 取肉豆蔻叶片，按照2010年版《中国药典》附录XD方法提取挥发油，叶片为鲜叶，提取工艺为:纯水浸泡2 h，料液比1∶10，提取8 h。挥发油加适量无水硫酸钠脱水，挥发油为淡黄色，收率为雄株叶片为(0.47±0.3)% (g/g)，雌株叶片为 (0.41±0.2)%(g/g)。取挥发油适量，乙醚为溶剂，过0.45 μm有机滤膜，备用。

1.2.2 质谱条件 HP-5MS毛细管柱 (0.25 mm×30 m，0.25 μm);进样口温度240℃，升温程序为初温40℃，以5℃/min升温到280℃;载气为高纯氦气，流量1 uL/min，进样量1μL，分流比30∶1，FID检测器温度250℃。EI电离源，70 ev，离子源温度230℃，柱前压5.10×104Pa，扫描范围 (m/z):35～550。

1.2.3 数据分析 不同月份叶片挥发油的色谱数据由中药色谱指纹图谱相似度评价系统比较其相似性;分别取1、3、5、7、9、11月份雌、雄株挥发油在上述的GC-MS条件下分析，所得质谱图经计算机处理和NIST05标准质谱图库检索，确定化合物，按峰面积归一法计算样品中各化合物在挥发油中的相对百分数。

2 结果与分析

2.1 不同月份挥发油相似度比较 在上述色谱条件下，连续进样，记录色谱图，结果表明色谱仪的精密度，重复性，系统适用性较好。将不同月份肉豆蔻挥发油的色谱输数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行数据处理，12个月份的挥发油中共有25个共有峰 (见图1)，各个峰的相对含有量以及样品的相似度见表2。25个共有峰保留时间的RSD均小于0.07%，说明样品的重现性和稳定性较好，但是通过相对含有量的RSD可知，不同月份的挥发油中各个峰有一定的变化。由表2可知:共有峰14不同月份相对含有量的RSD为106.14%，该成分在7、8月的相对含有量最高，其他月份明显较低，其他峰在不同月份的相对含有量的变化较小。由相似度分析可知12个样品的相似度均在0.900以上，说明了样品的一致性较好。相似度的差异可能是由不同月份挥发油中成分相对含有量的变化引起。

图1 1月份叶片挥发油的色谱图Fig.1 Chromatogram of volatile oil in leaves from January

2.2 叶片挥发油成分分析 在上述GC-MS条件下，取单月肉豆蔻雌、雄株叶片的挥发油适量，乙醚溶解进样，样品总离子流图 (见图2)经质谱扫描后，经计算机数据库系统检索确定其挥发油的成分，按照峰面积归一法计算挥发油中各组分的相对含有量。肉豆蔻雌雄株叶片中挥发油的主要成分为单萜类成分，每个样品中单萜类物质占该样品成分总数的46.67%～50.00%之间;其次为倍半萜类成分，相对含有量在34.09%～44.18%之间。此外叶片中还含有芳香类物质、二萜等成分。叶片中相对含有量较高的成分主要是:α-蒎烯 (9.10% ～20.10%)、β-蒎 烯 (5.53% ～19.64%)、4-萜品醇(9.93% ～ 13.58%)、γ-松油烯 (3.32%～7.50%)、肉豆蔻醚 (1.30%～11.24%)、α-水芹烯 (1.16% ～3.31%)、3-蒈烯(0.21%～4.44%)、α-松油醇(2.12%～3.75%)等。Madhavan［7］研究的肉豆蔻叶油中主要成分为:α-蒎烯，桧烯，苎烯等;陈迪华等［8］研究表明叶油中主要成分为 α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、肉豆蔻醚与本结果相似但含有量有差异。Lavanya在对雌雄株的研究中显示雄株和雌株的GC图谱没有区别，雌株叶油中肉豆蔻醚和榄香素的含有量显著低于雄株叶油，与本实验的结果相同。此外表-双环倍半水芹烯、α-紫穗槐烯、β-律草烯、叶绿醇等物质第一次从肉豆蔻叶片中分离得到。

表2 不同月份叶片挥发油中共有峰的相对含有量、相似度Tab.2 Relative contents of common peaks and similarity of volatile oil from leaves in different months

图2 3月份雌雄株挥发油总离子流图Fig.2 Total ion currents of volatile oil from leaves of male and female in March

2.3 主要成分数量的变化 根据GC-MS检测的结果，肉豆蔻1、3、5、7、9、11月份雌雄株叶片挥发油成分相对含有量大于0.1%的物质数量随月份变化见图3。有图可知，主要成分数量的变化在前几个月的变化不大，但在11月份雌株中成分的数量明显低于雄株。10、11月是海南肉豆蔻收获的季节，果仁积累物质的重要时期，物质贮存向果仁转变，也可能与合成酶的活性有关，因此雌株中含量的物质发生了减少。

图3 主要成分 (＞0.1%)数量变化Fig.3 Variation of the number of the main components(＞0.1%)

表3 肉豆蔻叶片挥发油中主要成分Tab.3 Main components of volatile oil from leaves of Myristica fragrans Houtt

续表3

续表3

2.4 主要成分含有量变化 肉豆蔻叶片中含有量最高的为α-蒎烯、β-蒎烯、4-萜品醇，但3种成分的动态变化已有报道。在此选择具有肉豆蔻特征性成分:γ-松油烯、3-蒈烯、α-水芹烯、异丁香酚和肉豆蔻醚，观察动态变化趋势。由图4可知5种成分中变化幅度最大的为肉豆蔻醚，雌株叶片中7月份含有量最高达到10.25%，1月最低仅为1.30%;雄株中3月份含有量最高:11.24%，7月最低:1.68%。其他几种成分的变化幅度相对较小，异丁香酚和α-水芹烯相对含有量比较稳定。3-蒈烯的变化幅度也较大，雌株1、3月含有量最低0.21%、0.87%;雄株5月含有量最低:0.15%，但值得注意的是在3-蒈烯相对含有量最低的样品中2-蒈烯的含有量相对较高;说明两者之间在植物体内有异构体相互转化的可能性。

图4 5种成分的变化趋势Fig.4 Trends of contents of five components

3 讨论

肉豆蔻叶片挥发油中萜类成分与前人研究的种仁中的差异不大，肉豆蔻中的活性物质如:肉豆蔻醚、榄香素、丁香酚、异丁香酚和黄樟脑等在叶片中都检测到，但含有量与前人研究的有差异。王莹对商品肉豆蔻中挥发油分析中肉豆蔻醚、榄香素、丁香酚的含有量 (最小值)分别为:37.63%、1.77%、0.4%均高于本实验结果，异丁香酚的含有量差异不大;Muchtaridi等［9］测得肉豆蔻种仁挥发油中这几种成分的含有量也均高于本实验结果。肉豆蔻中的这几个成分既是活性物质也是有毒物质，肉豆蔻醚和榄香素即是抗氧化的有效成分［10］，也是致幻［11］的毒性物质，也有研究表明丁香酚也可能会提高致幻作用［12］，这些成分在食品、调味品中的添加量上也做了明确的限制［13］，因此肉豆蔻资源在开发利用中要慎重。

在前期的研究中发现肉豆蔻雌株挥发油的含有量高于雄株，雌株在4、10月的含油量最高，雄株呈现先升高再降低最后趋于稳定的趋势。在对雌雄株中含有量大于0.1%成分的数量上的比较中两者没有差异，化合物中单萜类，倍半萜成分的比例差异不大，通过样雌雄株的样品的GC图谱的相似度比较可以确定肉豆蔻雌雄株叶片挥发油成分差异不大。但是雌株叶片中肉豆蔻醚和榄香素的含有量显著低于雄株叶油，而前人在对肉豆蔻种仁挥发油的的GC-MS分析中:肉豆蔻醚和榄香素的含有量都相当的高［5，9］。两化合物在雌雄株中含有量的差异性的原因还有待进一步研究。

肉豆蔻在海南引种栽培已有研究，在对其气候适应性分析表明海南有较大面积适宜该物种的栽培［14］。肉豆蔻叶片成分比较研究对其资源的利用，叶片挥发油质量控制，化学成分指纹图谱的制定提供了科学依据。同时对肉豆蔻规范化种植，资源开发都有重要意义。

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