反相离子对高效液相色谱法测定盐酸林可霉素注射液中乙二胺四乙酸二钠的含量

屈 蓉，钱桂英，陈 佳

江苏省泰州市食品药品检验所，泰州 225300

日常检验中发现，部分生产厂家的盐酸林可霉素注射液标示辅料有乙二胺四乙酸二钠 （EDTA-2Na），这是一种常用的稳定剂，在制备注射剂时加入EDTA-2Na，它与微量的金属离子形成螯合物后，阻止了金属离子对药物自身氧化的催化作用，有利于提高药物在制备、存储和临床配制过程中的稳定性。EDTA-2Na被列为GRAS安全物质,收载于美国FDA《非活性组分指南》,英国也许可用于非注射和注射给药制剂。在药物剂型中EDTA-2Na被用作螯合剂的一般浓度为0.005%～0.1%（W/V）[1]。由于EDTA-2Na可与钙离子结合成可溶的络合物引起钙的减少，静脉注射制剂中使用EDTA-2Na会导致血钙下降，因此，须密切关注和严格控制静脉给药制剂中EDTA-2Na的用量。参照相关文献，本文建立了盐酸林可霉素注射液中EDTA-2Na的含量测定方法。

1 仪器与试药

Waters 2695-2996高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，Empower化学工作站 （美国Waters公司）；梅特勒AG135电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；PHS-25型酸度计 （北京华瑞博远科技发展有限公司）。

盐酸林可霉素注射液 （规格为2 mL：0.6 g，批号：0912232、1009242、1001245，山东方明药业股份有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na，上海中试化工总公司，批号：20080925，纯度：97.0%,分析纯）；甲醇为色谱纯；氯化铁、四丁基氢氧化铵、甲酸均为分析纯;水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件和系统适用性试验

色谱柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：含12.5%（体积分数）甲醇和0.052%（体积分数）甲酸的水溶液（用四丁基氢氧化铵调节pH值至3.5）；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25℃。理论板数按EDTA-2Na计算为4530。

分别吸取供试品溶液、对照试剂溶液、阴性样品溶液各50μL，注入液相色谱仪，记录HPLC色谱图。结果表明，供试品色谱图在与对照试剂色谱图保留时间相应位置上出现色谱峰，阴性样品无干扰，见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取供试品5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加10 mg·mL-1的三氯化铁溶液0.1 mL，加水稀释至刻度，摇匀，静置30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照试剂贮备液 取 EDTA-2Na对照试剂51.91 mg，置50 mL棕色量瓶中，加水适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液5 mL，置50 mL棕色量瓶中，加入10 mg·mL-1的三氯化铁溶液0.5 mL，加水稀释至刻度，摇匀，静置30 min，备用。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方工艺制备不含EDTA-2Na的样品，按供试品溶液制备方法制备，作为阴性样品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 线性关系考察

分别量取“2.2.2”项下对照试剂贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成2.014、4.028、6.042、8.056、10.070、12.084 μg·mL-1的系列标准溶液。分别取上述各溶液50 μL进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，以EDTA-2Na对照试剂浓度为橫坐标 （μg· mL-1），进行线性回归。线性方程为Y=67948X-14085，r=0.9998。结果表明，EDTA-2Na在2.014～12.084 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取6.042 μg·mL-1的EDTA-2Na标准溶液50 μL，连续进样6次，峰面积RSD为0.5%，结果表明方法精密度良好。

2.5 稳定性试验

取“2.2.1”项下同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、10 h测定，结果峰面积RSD为0.8%，结果表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取批号1009242的样品共6份，按供试品溶液制备方法制备，重复测定，测得EDTA-2Na平均含量为23.27 μg/支，RSD为1.2%，表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密量取批号1009242的样品2.5 mL，共6份，置10 mL棕色量瓶中，分别精密加入含EDTA-2Na的12.084 μg·mL-1溶液2.5 mL后，按供试品溶液制备方法制备，测定峰面积，测得平均回收率为98.6%，RSD为1.1%。

2.8 检测限和定量限

将对照试剂贮备液逐级稀释后，按10∶1计算定量限，结果为10.1 ng，按3∶1计算检出限，结果为2.5 ng。

2.9 样品含量测定

按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制备3个不同批号盐酸林可霉素注射液 （批号分别为：0912232、1009242、1001245），EDTA-2Na含量分别为26.32 μg/支、23.27 μg/支、24.11 μg/支 （折算成浓度分别为0.001%、0.001%、0.001%）。

3 讨 论

3.1 由于EDTA-2Na易与金属离子螯合，在色谱柱中，EDTA-2Na和色谱柱不锈钢表面会发生络合，使EDTA-2Na的响应值低，峰形严重脱尾。为避免EDTA-2Na和色谱柱不锈钢表面发生作用，提高检测灵敏度，改善峰形，根据其可与一些金属离子生成具有紫外吸收的稳定络合物的性质进行测定，EDTA-2Na与Cu2+可形成稳定的螯合物，稳定常数= 1018，而与Fe3+可形成更为稳定的螯合物且有紫外吸收（紫外吸收光谱图见图2），稳定常数=1025.1[2]，故本方法选用EDTA-2Na与FeCl3反应形成稳定的螯合物，在254 nm波长处进行测定。

图2 EDTA-2Na-Fe络合物的紫外吸收光谱图

3.2 四丁基氢氧化铵是离子对试剂，四丁铵基与EDTA-2Na螯合铁离子结合成中性离子对，保留于C18固定相[3]。在反相离子对色谱中，流动相的pH值、离子强度、有机溶剂的种类、比例及离子对试剂的种类和浓度都将影响分离的选择性。曾试验采用了0.006 mol·L-1四丁基氢氧化铵溶液 （pH为6.5± 0.1）-乙睛 （75∶25）（取四丁基氢氧化铵6.0 mL于195 mL水中，用1 mol·L-1磷酸溶液调节pH至6.5± 0.1，加乙睛250 mL，加水至1000 mL，摇匀，即得），在此色谱系统中，对照品能较好的出峰，但样品在与对照品保留时间相应位置处出现信号较强的倒峰；又试验了含12.5%（体积分数）甲醇和0.052%（体积分数）甲酸的水溶液 （用四丁基溴化铵调节pH值至3.5），发现此色谱系统中EDTA-Fe络合物出峰太快，与杂质峰未能达到基线分离。采用本文所用的流动相，EDTA-Fe络合物峰形较好，且能与杂质峰达到基线分离，故采用此色谱条件。

3.3 样品中所加EDTA-2Na的量并未达到0.005%～0.1%的浓度范围，说明此工艺有待进一步考证。

[1] 刁岩忠，韩继永，陈祥峰.HPLC法测定注射用泮托拉唑钠中乙二胺四乙酸二钠的含量 [J].药物分析杂志，2011，31（2）：282.

[2] 黄 建，李文仙，霍军生.反相离子对高效液相色谱法测定果味饮料中的乙二胺四乙酸二钠 [J].中国食品工业，2009（6）：56.

[3] 耿志旺，刘 蔚，刘 茜，等.HPLC法测定丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二钠含量[J].药物分析杂志，2011，31（3）：588.