来氟米特代谢物teriflunomide调节NFATc1基因抑制破骨细胞分化作用研究*

姚 瑶，丁从珠，葛卫红**

南京大学医学院附属鼓楼医院1药学部；2风湿免疫科，南京 210008

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种临床常见的以侵犯滑膜关节为主要特征的自身免疫性疾病，其发病机制复杂，病变过程涉及多种细胞[1]。研究表明，破骨细胞的活化是引起类风湿性关节炎骨破坏的关键[2]。来氟米特是一种免疫调节剂，在体内代谢为有活性的物质teriflunomide[3]（图1），临床用于缓解类风湿性关节炎病人炎症[4]。前期研究表明，来氟米特也能够抑制类风湿性关节炎引起的骨破坏。本实验研究来氟米特活性代谢物teriflunomide对人外周血单核细胞向破骨细胞分化的调节作用，从而探讨来氟米特对抗类风湿性关节炎骨破坏的作用机制。

图1 来氟米特及其活性代谢物结构式和生物转化

1 材料与试剂

Teriflunomide（苏州长征-欣凯制药有限公司，纯度为99.7%）；青藤碱标准品（中国药品生物制品检定所，纯度为99.8%）；改良型α-MEM培养液（Thermo公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；淋巴细胞分离液（天津市TBD生物技术发展中心）；重组人源巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF）、细胞核因子kB受体活化因子配基（RANKL，Peprotech公司）；TRAP染色试剂盒 （美国Sigma公司）；TRIzol（美国Invitrogen公司）；SYBR Premix试剂盒、引物（大连TaKaRa公司）。

2 方 法

2.1 健康人外周血单个核细胞（PBMC）的制备

安静状态下抽取静脉血用等量磷酸缓冲液（PBS）稀释混匀，将稀释的外周血沿管壁缓慢加至等体积的淋巴细胞分离液上面，保持两者界面清晰。水平离心机以2000 r·min-1常温离心20 min，吸出中间灰白色PBMC层至另一离心管，用10～15 mL PBS洗涤两次，依次以1500、1000 r·min-1转速离心10 min，吸弃上清。用含有15%胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞。

2.2 MTT法检测药物对细胞增殖的作用

将上述重悬的PBMC平均接种在96孔培养板中，调整细胞浓度为5×105/mL，每孔接种100 μL，加入M-CSF（20 ng·mL-1）培养24 h。后用不同浓度teriflunomide（1000、100、10 μmol·L-1）以及青藤碱1000 μmol·L-1（阳性对照）干预，以未加药物组作为空白对照组。继续培养48 h后每孔加入5 mg·mL-1噻唑蓝（MTT）20 μL，在37℃条件下继续孵育4 h后吸弃培养基，每孔加入150 μL二甲亚砜（DMSO），室温振荡10 min使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定570 nm波长处各孔的吸光度（OD）值，以每组3个孔的均值作为结果。

2.3 RANKL诱导破骨细胞

与上同法。将PBMC平均接种在96孔培养板中，调整细胞浓度为5×105/mL，每孔接种100 μL RANKL（60 ng·mL-1）和M-CSF（20 ng·mL-1）诱导分化。用不同浓度的teriflunomide（1000、100、10 μmol· L-1）干预，以未加药物组作为对照组。每3天换液一次，第15天终止培养，行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色；随机选取3个镜下视野（100倍，高倍镜视野20×20），计数TRAP阳性多核破骨细胞（≥2个核），取平均数，并留取细胞上清液。

2.4 NFATc1信号分子表达检测

调整细胞浓度为5×105/mL，每孔接种1000 μL，将PBMC平均接种在6孔培养板中，RANKL（60 ng·mL-1）和M-CSF（20 ng·mL-1）诱导分化。分别加入teriflunomide（1000、100、10 μmol·L-1）干预，以未加药物组作为对照组。37℃、5%CO2孵箱常规培养24 h。将上述分组处理后的细胞悬液移至环氧树脂（EP）管中，2000 r·min-1离心10 min。沉淀的细胞加入1 mL TRIzol抽提RNA，按试剂盒操作进行逆转录。逆转录结束后，收集cDNA样品并以相应的cDNA为模板进行 PCR扩增。冰浴溶化 SYBR Premix real-time PCR试剂，再将cDNA浓度调整在0.5 μg·μL-1左右。PCR反应体系总体积20 μL，在ABI Prism7500型高通量荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR，见表1。各基因每个标本做3个复孔。扩增条件：第一步（预变性），95℃ 30 s，1个循环；第二步（PCR反应）95℃ 5 s，60℃ 34 s，各40个循环。

表1 实时荧光定量PCR（polymerase chain reaction）引物序列

2.5 统计学处理

实验结果采用SPSS 16.0统计分析软件以及单因素方差分析数据，检测各组之间是否存在差异，P＜0.05为具有统计学差异。

3 结 果

3.1 不同加药组对PBMC增殖的影响

由表2可见，MTT结果显示不同浓度的teriflunomide（1000、100、10 μmol·L-1）以及阳性对照青藤碱处理细胞48 h后，细胞的增殖的情况，结果显示组间无差异（P＞0.05）。

表2 不同加药组对PBMC增殖的影响，n=3）

表2 不同加药组对PBMC增殖的影响，n=3）

注：a与对照组比较P＞0.05

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3.2 Teriflunomide对破骨细胞分化的干预

细胞培养15天后行TRAP染色，细胞胞质红褐色，胞核蓝染，体积明显增大，形态不规则，多核，以2～3个核为主 （见图2）。药物处理诱导分化的PBMC，各加药组对破骨细胞（OC）的分化均有不同程度的抑制作用，15天后抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色后显微镜下观察分化成熟的OC数目，结果显示teriflunomide随着浓度的增加，对OC分化的抑制作用越显著（P＜0.05），见表3。

图2 显微镜下PMBC（A）以及TRAP染色破骨细胞（B）清晰可见多核

3.3 Teriflunomide对破骨细胞分化信号分子NFATc1表达的调控

根据仪器测定各样品Ct值，计算各平均Ct值，以GAPDH作为内参，将目标基因Ct值减去GAPDH的Ct值，得△Ct值。计算标准化后的2—ΔΔCt值表示mRNA的相对表达含量，见表4。结果显示，给药24 h后，1000 μmol·L-1teriflunomide能够有效下调PBMC中的NFATc1 mRNA表达（P＜0.05），其相对表达量为0.74，与阳性对照青藤碱无显著差异（P＞0.05）。

表3 不同加药组TRAP（+）OC数（n=3）

表4 不同加药组对NFATc1表达的影响（n=3）

4 讨 论

来氟米特临床用于治疗类风湿性关节炎，无论是单独使用还是与其他药物合用均能发挥强大的免疫抑制作用，且不良反应较少[5]。作用机理是通过抑制二氢乳清酸脱氢酶的活性而抑制嘧啶的从头合成途径，抑制酪酸激酶活性而抑制细胞激活时的信号转导。

Oh[6]的最新研究表明，teriflunomide能够显著抑制T细胞的增殖及其炎症因子的分泌。T细胞分泌的大量的炎症因子如TNF、IL-17等能够引起RA患者的滑膜炎，诱导滑膜组织增生。继而有研究表明，teriflunomide也能抑制RA患者滑膜细胞诸如RANKL、金属蛋白酶（MMPs）等的细胞因子分泌[7]，我们的前期研究也证实了这一观点。同时，最新研究证明teriflunomide不能促进Treg细胞的增殖，提示teriflunomide产生免疫抑制作用主要还是通过对T细胞和滑膜细胞的抑制[8]。研究表明，teriflunomide能够抑制活化的THP-1细胞表面CD147、MMP-2、MMP-9的表达[9]。RANKL作为重要的破骨细胞因子，来源于T细胞以及滑膜细胞，直接决定破骨细胞的分化，而MMPs是引起软骨和骨破坏的关键。在类风湿性关节炎环境下，炎症细胞分泌的趋化因子能够将外周血中单核细胞聚集到关节处，活化的T细胞以及异常增生的滑膜细胞分泌的大量的IL-1、IL-17以及RANKL等激活破骨细胞活化的重要转录因子NFATc1，从而使得PBMC分化为成熟的多核的破骨细胞，这些破骨细胞又能够附着在骨组织上，并分泌出MMPs，破坏软骨和骨组织，提示teriflunomide可能通过间接作用抑制RA患者的骨破坏[10]。

本研究以破骨细胞前体细胞PBMC为研究对象，研究来氟米特代谢物teriflunomide对PBMC增殖、RANKL诱导的分化以及分化过程中重要转录因子NFATc1表达的影响，探讨teriflunomide对破骨细胞前体细胞是否有着直接的作用。本课题组已证实青藤碱能够通过有效抑制NFATc1基因的表达，从而抑制破骨细胞的分化，因此，本研究以青藤碱为阳性对照。TRAP染色结果证实其能够有效抑制PBMC向多核OC分化，Real-time PCR结果则显示teriflunomide对OC分化的抑制作用可能是通过有效抑制NFATc1基因的表达，而MTT结果说明，teriflunomide并不能影响正常PBMC的增殖。提示 teriflunomide能够 直接 阻断 RANKL激 活NFATc1的通路，抑制骨破坏的作用，且对正常PBMC的功能并无特殊影响。这一点与Kobayashi[11]的研究结果相符。

综上所述，teriflunomide既可以通过调剂免疫，减缓炎症，抑制RA引起的骨破坏，同时也能够直接作用于破骨细胞前体细胞，通过调节NFATc1基因的表达直接抑制其分化，进一步缓解骨破坏的进程。因此，类风湿性关节炎伴骨破坏患者，应推荐来氟米特治疗。

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