MAPK信号通路在新生隐球菌致病机制中的作用

皇幼明 朱红梅 温海

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室上海长征医院皮肤科，上海 200003)

隐球菌是担子菌酵母类真菌，在人类和动物中可引起隐球菌病。大部分人类隐球菌病发生在免疫受损人群，但也可在免疫正常人群中发病。隐球菌性脑膜炎由于其高致病性、难治愈性，正引起人们广泛的关注。树、鸽粪、土壤等是适宜隐球菌的自然生态环境，这些环境可刺激交配和孢子生长［1］。新生/格特隐球菌共有四种血清类型:血清A型(新生隐球菌格鲁比变种)，血清B和 C型(格特隐球菌)，血清D型 (新生隐球菌新生变种)。不同血清型的隐球菌在生态分布、毒力方面存在不同程度的差异。公认的隐球菌毒力因子主要有四种:荚膜、产生黑素、37℃生长、胞外分泌酶［2-5］。另外，交配型、表型转换、抗菌药物敏感性以及应对外界信号应激的胞内信号转导通路均对毒力有着不同程度的影响。已有越来越多的研究关注这些毒力影响因素。因此，阐明毒力相关的致病机制对隐球菌病的诊治具有重要意义。但目前关于这一系统的具体机制还不清楚。本文就促分裂原蛋白激酶信号转导通路如何调控毒力因子的机制作一阐述。

1MAPK通路概述

隐球菌是一种全球分布的真菌，主要分布于土壤、桉树、鸟粪中。隐球菌细胞外环境由多种物理和生物因素组合而成，极大地影响着其生存和发展。隐球菌在感染哺乳动物宿主时亦暴露于环境变化中，它必须要感受这些变化、迅速地对胞外信号做出反应使自身能够灵活地应对这些外界环境变化，以利于定植和繁殖。某些胞外信号可能影响毒力的变化。隐球菌感受并传递胞外信号调整自身生理活动需要复杂的信号转导系统。

在进化过程中，真菌类生物已经发展了复杂而敏感的适应机制，使它们能够通过适当的细胞内信号活动来适应外部环境的变化。促分裂原蛋白激酶(MAPK)级联反应是细胞适应机制中的重要部分之一。MAPK通路由三种序列活化激酶组成。促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)激活并活化促分裂原活化蛋白激酶激酶 (MAPKK)，随后MAPKK激活促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)。在酿酒酵母菌中，已发现至少五种信号转导途径包含MAPK级联反应:细胞壁完整性通路、孢子壁组装通路、菌丝生长通路、信息素反应通路、高渗透性甘油通路，分别调节其生长、形态改变、繁殖和应激反应［6］。白念珠菌是最常见的侵袭性真菌，MAPK通路在白念珠菌的致病机制中的作用可能是介导白念珠菌感染中关键的形态学变化:酵母相向菌丝相的转换［7-8］。通过基因学分析和表型鉴定发现白念珠菌中存在三种MAPK通路:Mkc1(Mitogen-activated protein kinase)介导的细胞壁完整性通路、Cek1/2(Candida extracellular regulated protein kinases-like kinase)介导的交配和丝化通路和 Hog1介导的高渗透性甘油通路。

近来，越来越多的证据表明，隐球菌的MAPK系统与酿酒酵母菌和白念珠菌有高度的相似，然而隐球菌的MAPK通路在毒力调控方面同时又具有一些自身独特的表现。类似的MAPK通路也在隐球菌与宿主的生存中发挥重要作用，如荚膜合成、形态转换等［9］，但已有的隐球菌MAPK通路的研究仅限于新生隐球菌血清A型、D型两种菌株，且该通路在两种菌株有血清特异性。

2MAPK通路构成

隐球菌的MAPK通路包括HOG-MAPK通路、PKC-MAPK通路及Ste12转录基因通路［10］。这些MAPK途径既可特异性的调节相关毒力因子，又与其他途径协同调节细胞壁的完整性、在37℃生长的能力、荚膜与黑素的生成、交配与丝化、以及对高渗应激、氧化应激和紫外线的抵抗。

2.1PKC-MAPK 通路

PKC/Mpk1-MAPK通路主要调节细胞壁完整性和高温下生长，在新生隐球菌抵抗渗透压、高温、氧化应激和硝酸化等压力中扮演重要角色，也在荚膜和黑素生成中发挥作用。此通路的关键成分包括小 GTP结合蛋白Rho1、Pkc1、Bck1(MAPKKK)、Mkk1(MAPKK)、Mpk1(MAPK)，其中 Mpk1 诱导下游组分影响毒力特征。

在白念珠菌中，Mkc1(Mpk1类似物)参与维持细胞壁合成和保持细胞壁稳定［8］。在新生隐球菌中也发现类似途径协同参与应对高温反应［11］。该途径的核心成分是Mpk1，参与维持细胞壁的稳定性，是新生隐球菌在37℃下生长的重要影响因子。当隐球菌处于氧化应激等细胞壁受损条件下时，Mpk1被磷酸化激活。激活的Mpk1完全依赖Pkc1发挥压力应对反应。新生隐球菌Mpk1△突变株在小鼠隐球菌病模型中表现出毒力下降［11］和对抗菌药物敏感性的增加［12］。pkc1 突变株对吡咯类抗真菌药物的敏感性增加，提示该途径可能参与新生隐球菌的药物抵抗。Bahn等还发现 Bck1△、Mkk1△、Mpk1△突变株都表现出对氧化应激、高温、抗菌药物相似的高敏感性，说明这3种基因处于同一信号传导通路之中［13］。Gerik等发现Pkc1△突变株中，几丁质和壳聚糖的锚 定 受 损。Pkc1△突 变 株 和 Bck1△、Mkk1△、Mpk1△突变株的细胞壁都受到损害，但Pkc1突变株的损害更为严重［14］。另外研究发现，Pkc1△突变株表现出了荚膜缺陷和黑素的减少，而Bck1△、Mkk1△、Mpk1△缺陷株的上述毒力特征并没有受到影响。研究表明在Pkc1-MAPK通路外，Pkc1可能通过调节多种信号转导通路或者Pkc1下游存在某种代偿途径来维持细胞壁的稳定。

几丁质是细胞壁重要组成部分，有研究发现白念珠菌编码几丁质合成酶基因的调节依赖与三种信号途径:钙调蛋白、PKC和 HOG途径［15-16］，这些信号途径并不独立发挥作用，而是构成交叉、反馈和补偿机制组成的相互协调网络。细胞壁的合成和完整性可以有效应对氧化和氮化应激反应，对真菌的生存至关重要。Kojima等［17］发现吡咯类抗真菌药物引起野生株细胞肿胀、染色质分裂异常，而Hog1突变株无变化，提示Hog基因在激活状态下可能会导致细胞形态异常。钙调蛋白突变株对吡咯类抗真菌药物敏感，且吡咯类抗真菌药物和钙调蛋白抑制剂FK506可以协同抑制新生隐球菌生长，提示Mpk1和钙调蛋白可能协同调节新生隐球菌细胞壁完整性从而影响其药物敏感性。故hog1是否亦参与了Pkc1对这些应激的反应值得进一步研究证明。另外磷脂酶C也可活化PKC/MAPK信号级联，磷脂酶C亦介导肌醇-1，4，5-三磷酸盐的生成，后者作为第二信使在Ca2+途径中起作用发挥对细胞壁完整性的调节。而磷脂酶C突变株在调节黑素生成、37℃下生长等致病因子方面存在缺陷。

2.2HOG-MAPK 通路

HOG-MAPK通路是酵母菌在高渗压力环境中生存所必须的。真菌生长环境的渗透压变化形式多样，在高浓度糖条件下成熟繁殖为其特征。由于酵母菌是非运动性的，不能逃离有害的环境，它们必须要通过不断调节胞内的活动来适应外部渗透压力的升高变化，其中涉及多种途径来提高内部渗透压，如合成和保留兼容的等渗物质比如甘油等［18］，调节水分的外流，调节细胞周期的变化。

白念珠菌HOG-MAPK通路至少涉及三种相对独立的过程:对外界压力的反应和适应、形态转化、细胞壁合成，该通路涉及多种组氨酸激酶，但具体作用机制不明。酿酒酵母的压力应激反应由高渗透性甘油促分裂原蛋白激酶信号转导途径中的促有丝分裂原蛋白激酶Hog1调节［19］，Hog1p是其中关键因子。在高渗透性条件下，信号通过两条途径汇合，激活MAPKK(Pbs2)，后者转而激活特异性Hog1。激活的Hog1进入细胞核，调控胁迫应答相关基因的表达 (如甘油合成基因)来应对高渗压力，并介导该时期细胞周期的阻滞，从而增强细胞对外界不利环境的适应能力。

新生隐球菌HOG通路保留其他真菌的这些特征，同时有具备自身的特点。新生隐球菌D型菌株的HOG通路与其他真菌类似，在正常条件下，Hog1基因处于去磷酸化状态。而大部分新生隐球菌株中，Hog1基因在正常条件下处于磷酸化状态，当出现高渗压力时，Hog1基因迅速去磷酸化。有趣的是，磷酸化与压力抵抗性和毒力相关，Hog1磷酸化越多，压力抵抗性越高［12-13，20-21］。且有研究发现新生隐球菌血清A型菌株H99对渗透反应的抵抗力高于血清 D 型菌株 JEC21［22］。Bahn 等［21］发现Pbs2在Hog1的磷酸化中发挥重要作用。Hog1的磷酸化高度依赖于Pbs2，因为Pbs2△缺陷株和Hog1△缺陷株表现出了高度相似性的表型。另外还发现正常条件下磷酸化的Hog1基因可能参与负性调解毒力因子如荚膜和黑素的生成、性分化，这可能是通过与cAMP信号通路和信息素转导通路的交叉作用来调解的，例如与野生菌株相比，hog1突变株和pbs2突变株的毒力降低。由于两种突变菌株的荚膜合成和黑素产生升高，但是却表现出毒力的减弱，推测在毒力升高的作用上，菌株对压力应激能力及敏感性的增高能够抵消一些荚膜、黑素合成增加所造成的毒力变化。但是正常条件下去磷酸化Hog1基因的新生隐球菌菌株如JEC21却没有这种表现。

双组分信号转导模式已经引起了医学真菌界的重视［23］，此模式构成酿酒酵母HOG信号级联的上游途径。虽然关于新生隐球菌HOG信号途径上游部分的具体结构还不明确，其中可能包括七种感受因子激酶，Tco1-Tco7(two-components-like proteins)，Ypd1 和反应调节因子 Ssk1 和 Skn7［13］。Ssk1是主要的的上游信号调节因子。Skn7主要参与高盐和氧化应激反应、黑素生成和毒力的调节［24］。在血清型D菌株的研究中，Skn7可能通过抵抗溶酶体杀伤而协助菌体在溶酶体内生存［25］。在上述七种Tco蛋白中，Tco1和Tco2在磷酸化传递系统中扮演最重要作用，两者在对抗真菌药物吡咯类的敏感性方面有同样作用［13］。并且还发现，Tco1参与黑素合成及毒力如性分化的调节，而Tco2在保护细胞壁免遭受氧化应激中发挥部分作用。因此推测双组分信号转导模式调节压力反应、药物敏感性、有性繁殖和毒力变化。

2.3 Ste12转录因子通路

Ste12主要参与调节酵母菌信息素信号转导通路，在酿酒酵母和白念珠菌中调节其交配、丝化和毒力。Ste12基因编码Ste12蛋白，后者在酿酒酵母菌MAPK通路参与调节交配过程。在白念珠菌中，该蛋白通路涉及形态转换和丝化过程，在白念珠菌侵袭性扩散中发挥重要作用。类似Ste12基因同样存在在隐球菌中，调控MAPK交配通路。Ste12基因存在于交配基因位点内，包括Ste12α和Ste12a两型，分别特异存在于α细胞和a细胞中。Ste12基因参与交配和菌丝生长过程，但并不发挥关键作用［26-27］，可控制已知相关毒力基因如荚膜和黑素相关基因的表达［26，28-29］，而Ste12α株一般比 Ste12a株毒力更强［30］。Davidson及其他一些学者发现新生隐球菌MAPK交配通路的上游成分并不调控毒力变化，Ste12α或者Ste12a 的缺失可导致交配频率降低［26，29］。另有研究发现，在血清A型菌株中Ste12的缺失未表现出毒力的变化，而在血清D型中却表现为毒力的减弱［29，31］。但是在格特隐球菌中，敲除同样的基因却可导致严重的毒力下降［32］。可知，Ste12参与菌株毒力的调控，但却不是交配通路调节中所必须的，而且存在菌株间差异。

Davidson等［27］发现，通过交换彼此相反交配型菌株的基因，Ste12α和Ste12a可以互补彼此功能。但是，在菌丝的形成中，Ste12a在Ste12α突变菌株中的表达比Ste12α在Ste12a突变菌株中的表达更有效，表明Ste12基因在单倍子实体的作用可能受到其他基因等因素影响。在同一研究中发现，Ste12α和Ste12a调控感染老鼠脑脊液涂片中酵母细胞壁荚膜生长的大小，并且两者影响一些毒力相关基因的表达。但目前还无法明确α基因在a交配型菌株中的表达是否会增强其毒力，或a基因在α交配型菌株中的表达是否会减损其毒力，两者之间互补彼此功能的机制仍有待证实。

3 小 结

病原真菌的MAPK途径对于其在宿主内的生存和繁殖具有重要作用。这些MAPK信号转导通路以一系列磷酸化级联反应为特征，调节真菌的致病性、细胞壁合成和完整性、细胞生长、丝化、交配及应对外界应激的反应。由于这些途径内部存在高度的特异化，如交配型特异性和血清型特异性，因此导致菌株间毒力的不同。参考其他真菌如酿酒酵母和白念珠菌中这些级联反应的类似组分的已知作用，有助于我们去探寻它们在隐球菌致病机制中的功能。隐球菌胞内存在多种MAPK信号通路，在不同的条件下由不同的外界应激所激活，不同的MAPK通路调节不同毒力因子的变化，发挥不同功能，如ste12、HOG、PKC三条通路分别在繁殖和侵袭性生长、高渗透压力、细胞壁完整性中发挥关键作用，而HOG和PKC均在氧化应激和氮化应激条件发挥重要作用。同时，三种途径都调控荚膜合成和黑素的产生。在MAPK途径之间及与其他途径之间，也存在着交叉，反馈及补偿机制，这些在动物感染模型中通过去除菌株中这些级联反应的某些基因成分而导致致病性减弱的实验中体现出来，但是，关于这种相关性在不同宿主体内是否相同，需要更多研究去证实。

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