两组鲍曼不动杆菌对Hep－2细胞黏附及致其凋亡情况的研究

刘彩霞 乔增培 杨锦红 李向阳

鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii，AB)作为条件致病菌，广泛分布于自然界。近年来，因其在医院内感染中的分离率和泛耐药菌株的迅速增多而引起广泛关注。2007年Smith等［1］通过直接测序，运用比较基因组学的方法发现，AB基因组中含有许多外来基因岛，除了一些插入元件和耐药基因外，还包括一些毒力基因;他们还通过插入突变的方法获得了一株无毒力的鲍曼不动杆菌。那么各种耐药基因盒的随机插入，是否引起临床上不同耐药表型AB致病力的改变呢?本实验拟通过对全敏感和泛耐药两组AB对Hep－2细胞的黏附及致其病变情况的观察，分析两组AB之间黏附定植及诱导细胞凋亡能力上的差异。

对象与方法

1.菌株基本情况:(1)鉴定与药敏:40株AB均采用Walk-Away 96SI全自动微生物鉴定/药敏系统进行鉴定及药敏。所测抗菌药物包括:头孢噻肟、头孢他啶、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林、替卡西林/克拉维酸、头孢吡肟、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、亚胺培南、复方新诺明、妥布霉素、左旋氧氟沙星、头孢曲松、氨曲南和头孢哌酮/舒巴坦。(2)菌株分布:20株泛耐药菌株均分离自成人ICU患者的痰液标本，20株全敏感菌株分离自新生儿、儿童留观室、儿童感染科和儿童呼吸科患者的痰液标本。泛耐药菌株为对上述17种药物均耐药，全敏感菌株则对上述17种药物均敏感。

2.细胞培养及相关试剂:Hep－2细胞株购自上海细胞库，RPMI1640培养基按GIBCO的说明书配制，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，0.25%的胰酶、细胞培养瓶和培养板均购自吉泰生物医药技术有限公司，凋亡DNA Ladder提取试剂盒购自上海超研生物科技有限公司。

3.方法:(1)菌株的培养:各菌株分别接种于LB肉汤，37℃过夜的培养，然后用PBS调菌液浓度为3×108CFU/ml备用。(2)菌株对Hep－2细胞的黏附功能测定:将2.5×105个/毫升的Hep－2细胞悬液接种于内置盖玻片的含RPMI 1640培养液3ml的6孔培养板中，过夜培养后，用事先预热的PBS冲洗3次，分别加入菌悬液0.5m l，37℃，5%CO2环境中培养2h，取出盖玻片，PBS漂洗3次，自然干燥，甲醇固定15 min，革兰染色，油镜下观察菌株对细胞的黏附情况并随机计数至少100个细胞，计算两组AB的平均细胞黏附率和黏附指数。细胞黏附率=被细菌黏附的细胞数/视野内总细胞数× 100%，细胞黏附指数 =黏附细菌数/视野内总细胞数 × 100%。(3)受染后细胞形态学及凋亡现象的检测:将Hep－2细胞分别接种于含和不含盖玻片的6孔培养板中，每孔加3m l培养液，待细胞基本铺满培养孔后，用事先预热的PBS洗2次，再加入3m l培养液;取0.5m l菌悬液分别加入到含和不含盖玻片的6孔培养板中，每株菌各加8个孔，放37℃ 5% CO2培养箱孵育，分别在8、12、16、20h观察细胞变化并收集细胞。取出盖玻片进行瑞氏染色，观察凋亡小体。收集的细胞按细胞凋亡－DNA Ladder抽提试剂盒说明书操作提取DNA，然后进行电泳。

结果

1.鲍曼不动杆菌对Hep－2细胞的黏附:①黏附形式:全敏感菌株对细胞的黏附多以周围分散广泛黏附为主;泛耐药菌株以在细胞的某一区域局部黏附为主，且更易被细胞吞噬。如下图1所示;②平均细胞黏附率和黏附指数:两组AB的细胞黏附率和黏附指数如表1所示。

2.细胞形态学变化:全敏感菌株组引起细胞形态改变明显，16h时Hep－2细胞已基本变圆浮起，20h时几乎无贴壁细胞。泛耐药菌株组引起细胞形态改变相对较缓慢，20h时仍有一些贴壁细胞。具体变化如图2所示。

图1 不同AB菌株黏附于Hep－2细胞的形式A.AB在细胞周围的广泛黏附;B.AB在细胞的局部黏附;C.部分细菌被吞入细胞的胞质内

表1 两组AB对Hep－2细胞的黏附情况(%±s)

表1 两组AB对Hep－2细胞的黏附情况(%±s)

两组之间比较，*P＜0.05

组别 平均细胞黏附率 平均细胞黏附指数全敏感组 57.05±4.93* 105.2±9.53*泛耐药组 40.20±4.56* 111.1±9.26*

3.凋亡细胞的观察:感染后各菌株各时间段标本经瑞氏染色，油镜下观察，以16h细胞变化最大，破碎的细胞多见。典型的凋亡细胞较少见。各种细胞形态如图3所示。

4.细胞凋亡的琼脂糖电泳检测:两组鲍曼不动杆菌均可诱导Hep－2细胞发生凋亡，但时间上略有差异。全敏感组致细胞凋亡高峰多出现在12～16h;泛耐药组致细胞凋亡高峰多出现16～20h。部分菌株凋亡电泳图如图4所示。

讨论

鲍曼不动杆菌对干燥及普通的消毒剂具有极强的耐受性，对由该菌引起的院内感染病人，在其出院9天后，其床边物表仍可分离到同一克隆菌株［2］。众多的研究表明，无论是省内、国内还是国际上都存在几个多重耐药克隆株引起医院感染的报道［3～5］。多重耐药克隆菌株较敏感克隆菌株更易播散，但两者的致病能力有何差异，目前的研究尚未揭示答案。

图4 两组细菌在不同时间点致Hep－2细胞凋亡的典型凋亡电泳图

鲍曼不动杆菌不分泌毒素和侵袭性酶类，其毒力因子和致病机制也是目前的研究热点。Nural等［6］报道称鲍曼不动杆菌对上皮细胞的黏附存在甘露糖抵抗现象，这种甘露糖抵抗的黏附现象是由P型菌毛介导的，具有受体特异性。本实验结果显示，全敏感组菌株对Hep－2细胞的黏附方式以分散广泛黏附为主，而泛耐药菌株的黏附以大量细菌局部黏附为主，由此推测全敏感菌株表面黏附素的表达较泛耐药组菌株充分，导致黏附方式存在差异，这可能与细胞的吞噬杀伤相关，同时大量的细菌局部聚集还可能形成了生物被膜或其他的原因造成免疫逃逸，短时间内导致细菌与细胞共存。目前对于鲍曼不动杆菌毒力因子的研究中，以外膜蛋白(outer membrane proteins，OMP)的研究较为深入。OMP不仅在细菌的耐药中起重要作用，而且在细菌侵入和诱导宿主细胞病变中也扮演重要角色。Choi等［7，8］认为OmpA直接介导了鲍曼不动杆菌对上皮细胞的侵入;在鲍曼不动杆菌感染宿主细胞后Omp38定位于宿主细胞线粒体和细胞核，并释放促凋亡因子如细胞色素C和AIF，后者介导caspase依赖和AIF依赖的凋亡机制，促使上皮细胞凋亡。Mussi等的研究表明，当carO基因前有插入序列时，会发生插入失活导致carO基因不表达。说明外来的插入序列可能导致菌株OMP基因的失活。国内王辉等［4］通过亚胺培南体外突变筛选研究发现，菌株的OMP图谱发生很大的改变，存在一些OMP的缺失和表达量降低。本实验中泛耐药组细菌致细胞病变缓慢而不明显，诱导Hep－2细胞凋亡时间较全敏感组菌株滞后，可能与泛耐药组菌株存在OMP缺失和表达量降低有关，同时也说明鲍曼不动杆菌还存在其他的诱导细胞凋亡的毒力因子。

综上所述，本实验从宏观上证明药敏情况完全不同的两组细菌对细胞的黏附和致病变能力存在较大差异。说明泛耐药菌株在各种抗菌药物的压力下可能处于一种营养不良状态，一方面毒力因子的弱表达，致病变能力减弱的同时导致了免疫逃逸，另一方面耐药基因的获得和自身突变，增强了对抗菌药物的耐受。这可能是多重耐药克隆株易于流行的部分原因。同时我们还需警惕强毒力株的产生，各种可移动元件的随机插入可能导入外源毒力基因，也可能活化菌株自身毒力基因的高表达，从而诱导出强毒力株，所以需要临床工作中的长期关注。

1 Smith GM，Gianoulis TA，Pukatzki S，etal.New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high－density pyrosequencing and transposon mutagenesis［J］.Genes Dev，2007，21(5):601－614

2 Richet HM.Nosocomial gram negative bacilli:they are back!Dealing with Acinetobacter，44thInterscience conference on Antimicrobial A-gents and chemotheraphy，October30～November2，2004，Washington DC

3 裘莉佩，潘登，徐炜烽，等.鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因型及分子流行病学研究［J］.中华流行病学杂志，2007，28(4):381－384

4 王辉，郭萍，孙宏莉，等.碳青霉烯酶类耐药的鲍曼不动杆菌分子流行病学及其泛耐药的分子机制［J］.中华检验医学杂志，2006，29 (12):1066－1073

5 Federico P，Andrea MH，Kristine MH，etal.Global challenge ofmultidrug－resistant acinetobacter baumannii［J］.Antimicrobial Agents Chemotherapy，2007，51(10):3471－3484

6 Nural C，Melek D，Ilknur K，et al.Evaluation of biofilm production gelatinase actibity and mannose－resistant hemagglutination in acinetobacter baumannii strains［J］.J Microbiol Immunol Infect.2008，41 (10):513－518

7 ChoiCH，Lee JS，Lee YC，etal.acinetobacter baumannii invadesepithelial cells and outer membrane protein A mediates interactions with epithelial cells［J］.BMCMicrobiol，2008，8(10):216－227

8 Choi CH，Lee EY，Lee YC，etal.Outermembrane protein 38 of acinetobacter baumannii localizes to themitochondria and induces apoptosis of epithelial cells［J］.Cell Microbiol，2005，7(8):1127－1138