脂联素对高糖环境心肌细胞氧化应激及凋亡的影响

李美蓉 李 兴

糖尿病心肌病是糖尿病主要的微血管并发症之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年来研究显示，氧化应激是糖尿病慢性并发症发生、发展的共同通路。衔接蛋白p66shc在氧化应激信号刺激下参与线粒体活性氧族产生，血红蛋白加氧酶－1(Ho－1)为胆红素降解的限速酶，是一种重要的抗氧化剂，两者变化影响体内氧化应激的状态。脂联素在调节糖、脂代谢和介导各种血管通路中起中心调节蛋白作用，可以通过抑制氧自由基产生，增加抗氧化能力，降低氧化应激。本实验观察了高糖环境下脂联素对心肌细胞p66shc、Ho－1表达的变化，旨在探讨脂联素对心肌细胞的保护作用。

材料与方法

1.材料:人心肌细胞购于美国SinceCell公司，经过形态学及细胞染色法鉴定。DMEM、0.25%胰蛋白酶、D－葡萄糖、青霉素链霉素(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青)、人重组脂联素(PEPRO TECH公司)、SOD、MDA试剂盒(南京建成生物公司)、Trizol试剂(Initrogen life technologies公司)、SYRB Green Mastar(Roche公司)、AnnexinV－FITC/PI(南京凯基公司)。

2.方法:(1)实验模型制作:人心肌细胞在37℃、5%CO2条件下以10%胎牛血清低糖(5.5mmol/L)DMEM培养基培养于25cm2培养瓶中。实验时，以无血清低糖DMEM饥饿培养细胞12h，待细胞生长至85%融合状态时，按以下方法分组:①对照组(N组):D－葡萄糖浓度5.5mmol/L;②高糖组(H组):D－葡萄糖浓度30mmol/L;③高糖+脂联素组(A组):D－葡萄糖浓度30mmol/L+脂联素浓度2.5μg/L。分别干预24、48、72h。(2)上清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测:分别用黄嘌呤氧化酶法检测SOD的含量和活性，用代巴比妥酸法检测MDA的含量。将细胞分为上述3组，每组设置24、48、72h 3个时间点，取每组每个时间点培养瓶中的上清液，密封后于－20℃保存。按SOD、MDA试剂盒说明检测各管吸光度，根据SOD、MDA含量公式计算其含量。(3)实时荧光定量PCR法:应用引物设计软件Primer5.0设计引物，并有康成生物有限公司合成。内参β－actin:上游:5'－agagctacgagctgcctgac－3'下游:5'－agcactgtgttggcgtacag－3'Ho－1:上游:5'－tccgatgggtccttacactc－3'下游:5'－taaggaagccagccaagaga－3'，P66Shc:上游:5'－cagctcttggcattttcctc－3'下游:5'－cagtctcgcggtaagagacc－3'。在上述各组个时间点弃上清的培养瓶中加入Trizol试剂裂解细胞后，按照说明书操作提取总RNA，反转录为cDNA，采用荧光定量PCR仪并使用SYBR Green法实时荧光定量PCR检测。反应条件:荧光定量PCR反应体系为20μl，在PCR扩增仪上按照94℃预变性10min，活化Tag酶;94℃15s，60℃60s，45个循环结束。荧光定量PCR读取CT值，采用2－ΔΔCt的方法计算Ho－1、P66Shc mRNA表达情况的相对定量结果。(4)流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率:采用AnnexinV－FITC/PI双标记染色法检测心肌细胞凋亡率。按上述分组将细胞培养于6孔板中，待测细胞浓度为0.5×108～1×109，PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，加入500μl Binding Buffer于细胞悬浮液中，加入5μl AnnexinV－FITC混匀后，加入5μl PI，混匀，室温避光孵育15min，用流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡率。

3.统计学方法:采用SPSS 13.0统计软件，各实验组数据均以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

结果

1.细胞上清液中SOD、MDA含量，反应心肌细胞氧化应激水平。与对照组相比24、48、72h高糖组SOD含量显著下降，MDA含量显著上升(P＜0.05)，与高糖组相比，脂联素组SOD含量显著上升，MDA含量显著下降(P＜0.05，表1、表2)。

2.血红蛋白加氧酶1和衔接蛋白P66Shc mRNA表达:与对照组相比高糖组Ho－1 mRNA表达增高;脂联素组较高糖组表达亦增高(P＜0.05)。与对照组相比高糖组P66Shc mRNA表达增高;脂联素组较高糖组表达亦降低(P＜0.05)(表3、表4)。

3.流式细胞术心肌细胞凋亡:高糖组细胞凋亡率较对照组明显增加，而脂联素组细胞凋亡率较高糖组显著下降(P＜0.05)(表5)。

表1 脂联素对高糖环境下人心肌细胞SOD的影响(U/m l±s，n=3)

表1 脂联素对高糖环境下人心肌细胞SOD的影响(U/m l±s，n=3)

与正常对照组相比，*P＜0.05;与高糖组相比，#P＜0.05

33.89±2.54 34.13±1.13 33.72±3.58高糖组 25.88±0.48* 23.74±0.52* 21.08±1.31*高糖+脂联素组 28.76±0.79 30.21±0.61# 31.16±0.93 24h 48h 72h低糖组组别#

表2 脂联素对高糖环境下人心肌细胞MDA的影响(nmol/L±s，n=3)

表2 脂联素对高糖环境下人心肌细胞MDA的影响(nmol/L±s，n=3)

与正常对照组相比，*P＜0.05;与高糖组相比，#P＜0.05

117.36±10.74 114.49±8.71 115.53±9.20高糖组 231.51±3.52*267.62±4.96*301.47±3.41*高糖+脂联素组 178.50±8.00#171.31±4.47#157.69±3.05 24h 48h 72h低糖组组别#

表3 脂联素对高糖环境下人心肌细胞Ho－1 mRNA表达的影响(2－△△Ct 值±s，n=3)

表3 脂联素对高糖环境下人心肌细胞Ho－1 mRNA表达的影响(2－△△Ct 值±s，n=3)

与正常对照组相比，*P＜0.05;与高糖组相比，#P＜0.05

1.026±0.009 1.039±0.012 1.042±0.009高糖组 1.728±0.183 2.216±0.240*2.6851±0.301*高糖+脂联素组 3.889±0.006#7.632±0.231#8.375±0.051 24h 48h 72h低糖组组别#

表4 脂联素对高糖环境下人心肌细胞P66ShcmRNA表达的影响(2－△△Ct值±s，n=3)

表4 脂联素对高糖环境下人心肌细胞P66ShcmRNA表达的影响(2－△△Ct值±s，n=3)

与正常对照组相比，*P＜0.05;与高糖组相比，#P＜0.05

1.058±0.031 1.030±0.176 1.049±0.023高糖组 1.521±0.079*1.767±0.119*2.112±0.094*高糖+脂联素组 1.318±0.023#1.196±0.020#1.072±0.016 24h 48h 72h低糖组组别#

表5 脂联素对高糖环境下人心肌细胞凋亡率的影响(%±s，n=3)

表5 脂联素对高糖环境下人心肌细胞凋亡率的影响(%±s，n=3)

与正常对照组相比，*P＜0.05;与高糖组相比，#P＜0.05

组别4.68±1.24 4.77±1.89 5.06±1.67高糖组 15.29±1.46* 18.19±0.98* 23.85±0.76*高糖+脂联素组 10.98±0.68# 8.31±0.26# 7.59±0.41 24h 48h 72h低糖组#

讨论

糖尿病是一种以血糖代谢紊乱为特点的常见慢性疾病，在心脏可引起冠心病和糖尿病性心脏病。目前认为高血糖介导氧化应激是糖尿病及其并发症发生发展的关键因素。Brownlee［1］提出，氧化应激是糖尿病并发症的共同机制，并认为多元醇通路激活、蛋白非酶糖基化产物晚期糖基化产物的形成、蛋白激酶C激活、己糖胺途径激活都是由这一共同机制所激发。

衔接蛋白P66Shc是哺乳动物生命周期相关的蛋白，也是近年来研究细胞氧化应激的主要蛋白之一，其通过在线粒体内氧化细胞色素C产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)导致细胞氧化损伤［2］。P66Shc表达的调控包含2个层次，即翻译后调控和转录水平的调控。P66Shc的表达主要取决于转录水平的调控，即它的启动子发生了表观遗传学的修饰，导致基因转录的起始位点发生改变［3］。Rota等［4］的研究证实，高葡萄糖可以诱导离体的心脏干细胞氧化应激水平增加，并发生凋亡，而从p66shc－/－小鼠体内分离的心脏干细胞未发现明显凋亡，提示p66shc介导了高糖诱导的心肌细胞的氧化损伤。Sun等［5］的研究表明，在体外，高糖环境的肾小管上皮细胞P66Shc及其磷酸化形式表达增加，氧化应激水平增加，最终导致细胞存活率降低。本实验检测p66shc的mRNA水平反应心肌细胞氧化应激水平。

血红蛋白加氧酶－1是血红蛋白降解的限速酶，产生当量摩尔的一氧化碳、铁、胆绿素，是一种重要的抗氧化剂。关美萍［6］研究发现:初诊2型糖尿病(T2DM)合并慢性并发症患者的血糖水平、血清MDA、外周血单核细胞ROS产量及HO－1表达(mRNA or protein)均显著高于无并发症的患者，HO－1表达(mRNA or protein)与氧化应激指标呈显著正相关。Vulapalli等［7］的研究证实:转基因小鼠过度表达(mRNA or protein)α－肌球蛋白重链启动子使心脏选择性过度表达(mRNA or protein)HO－1，离体心脏和在体心脏在缺血再灌注损伤后，与非转基因对照相比，转基因鼠心脏恢复功能增强，心肌细胞凋亡减少。本试验检测HO－1mRNA水平反应心肌细胞抗氧化应激水平。

脂联素是脂肪组织分泌的一种特异性蛋白质，除参与糖脂代谢外，还具有抗炎、抗氧化应激、抗动脉粥样硬化、改善胰岛素抵抗等作用。Prior等［8］得研究发现脂联素启动子rs266729 3种变异基因型与糖尿病患者氧化应激水平之间的关联，GG型患者血浆脂联素水平高，对应的总抗氧化水平高，血浆氧化修饰低密度脂蛋白(oxidativelymodified low density lipoprotein，OX－LDL)水平低;CC/CG型患者血浆脂联素水平低，对应的总抗氧化水平低，血浆OX－LDL水平高，说明脂联素通过抗氧化应激发挥保护作用。Essick等［9］研究发现脂联素可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径、抑制细胞外信号调节激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)信号传导和转录因子(NF－κB)活化调节活性氧族(ROS)的量，抑制ROS诱导的心室重构。

本实验通过对高糖环境下心肌细胞不同时间段氧化应激水平和凋亡的检测，观察脂联素对高糖环境下心肌细胞氧化应激和凋亡的影响。发现高糖环境下的心肌细胞p66shc表达较正常组增加，加入脂联素组较高糖组降低。MDA是氧自由基和脂质反应的终产物，可间接反应氧自由基的多少。MDA的变化与p66shcRNA变化正相关。提示高糖环境下心肌细胞氧化应激状态较正常组高，脂联素组较高糖组低。由此可以推测脂联素可能通过降低p66shc mRNA表达，进而影响蛋白表达，使磷酸化的p66shc表达减少，降低氧化应激水平，但是本实验局限性未能做全各个水平。本实验发现高糖环境下心肌细胞随时间梯度HO－1 mRNA较正常组表达升高，是因为HO－1是应激性蛋白，但是结合MDA和SOD含量说明机体自身抗氧化防御功能的代偿增高尚不足以对抗高糖所致氧化应激，加入脂联素后HO－1 mRNA较高糖组表达升高，结合MDA和SOD含量可以反映氧化应激水平降低。说明脂联素通过增加HO－1 mRNA的含量使心肌细胞抗氧化应激水平升高，减少细胞凋亡。

综上所述，脂联素通过影响p66shc、HO－1表达影响减少氧化应激反应，减少心肌细胞凋亡，提高存活率。因此在积极控制血糖的同时，脂联素可能成为治疗糖尿病并发症的新途径。

1 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications［J］.Nature，2001，414(6865):813－820

2 Giorgio M，Migliaccio E，Orsini F，etal.Electron transfer between cytochromec and p66Shc generates reactive oxygen species that triggermitochondrial apoptosis［J］.Cell，2005，122(2):221－233

3 Ventura A，Luzi L，Pacini S，et al.The p66Shc longevity gene is silenced through epigeneticmodifications of an alternative promoter［J］.JBiol Chem，2002，277(25):22370－22376

4 Rota M，Lecapitaine N，Hosoda T，et al.Diabetes promotes cardiac stem cellaging and heart failure，which are prevented by deletion of the p66shc gene［J］.Circ Res，2006，99(1):42－52

5 Sun L，Xiao L，Nie J，et al.P66Shc mediates high－glucose and angiotensin II－induced oxidative stress renal tubular injury viamitochondrial－dependent apoptotic pathway［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2010，299(5):F1014－1025

6 关美萍.糖尿病患者慢性并发症与外周血单核细胞血红素加氧酶1表达的相关性研究［J］.中国糖尿病杂志，2009，17(12):929－932

7 Vulapalli SR，Chen Z，Chua BH，etal.Cardioselective overexpression of HO－1 prevents I/R induced cardiac dysfunction and apoptosis［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2002，283(2):H688－694

8 Prior SL，Gable DR，Cooper JA，et al.Association between the adiponectin promoter rs266729 gene variantand oxidative stress in patients with diabetesmellitus［J］.Eur Heart J，2009，30(10):1263－1269 9 Essick EE，Ouchi N，Wilson RM，et al.Adiponectin mediates cardioprotection in oxidative stress－induced cardiac myocyte remodeling［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2011，301(3):H984－993