胞磷胆碱钠注射液中辅料焦亚硫酸钠的含量测定

赵 明，张 娟，高 锦，嵇 杨，祁冰洁，赵春杰

（1.解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所质量保证室，北京100071；2.沈阳药科大学药学院药物分析学教研室，沈阳110016；3.解放军第309医院重症肌无力科，北京100091）

胞磷胆碱钠是一种神经保护剂，是内源性合成磷脂酰胆碱的中间体，为卵磷脂生物合成所必需的辅酶［1］。作为临床常用的神经激活剂，不同厂家胞磷胆碱钠注射液的处方及生产工艺各不相同，有的处方中不添加任何辅料，有的添加焦亚硫酸钠（Na2S2O5），且不同厂家加入量各不相同。焦亚硫酸钠是抗氧化剂，氧化后的残留物亚硫酸盐可引起包括细胞损伤、支气管痉挛和过敏在内的高度敏感性反应，其过敏反应发生率较高，有的甚至危及生命，故应对其加入量进行控制，以提高产品的安全性。焦亚硫酸钠作为药用辅料在《中华人民共和国药典》2010版二部［2］中收载，采用碘量滴定法进行含量测定，此法适用于辅料纯品的含量测定，而胞磷胆碱钠本身含有还原性基团，会干扰碘量法的测定结果。因此，建立高效、快速、准确、适于测定胞磷胆碱钠注射液中焦亚硫酸钠的含量测定方法很有必要。有关胞磷胆碱钠注射液中焦亚硫酸钠的含量测定方法国内外尚未见报道。本研究根据焦亚硫酸钠在酸性溶液中释放出的二氧化硫能使酸性品红溶液褪色的性质，建立了胞磷胆碱钠注射液中焦亚硫酸钠的含量测定方法，现报道如下。

1 仪器和试药

UV－2550型紫外－可见分光光度仪（日本岛津公司）；MES 235S电子天平（美国Starious公司）；无水亚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA－2Na）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；酸性品红、结晶乙酸钠（分析纯，北京化工厂）；冰乙酸（分析纯，天津市康科德科技有限公司）。胞磷胆碱钠注射液由国内药品生产厂A（批号100309、100524）、B（批号09053006、09080314、09090310、09100316、09100318、 09100319、09100320、10010324、10010325、10010503、10010514、10010521、10030312）、C（090330410、091120800）提供。水为二次重蒸水。

2 方法和结果

2.1 溶液制备 （1）酸性品红溶液：精密称取酸性品红0.34g，加硫酸1ml，加水溶解至1 000ml（7d内使用）。（2）乙酸盐缓冲液（pH＝4.8）：称取结晶乙酸钠136.1g，EDTA－2Na 0.4g，加入冰乙酸57ml，加水溶解并定容至1 000ml。（3）亚硫酸钠对照品溶液：精密称取无水亚硫酸钠55.0mg，用0.04%EDTA－2Na溶液溶解并定容至25ml。

2.2 检测波长的选择 精密量取酸性品红溶液8.0ml，共2份，分别置50ml量瓶中，各加乙酸盐缓冲液约30ml，分别加入亚硫酸钠对照品和供试品溶液各1.0ml，用乙酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，室温放置。在400～700nm波长范围内做扫描，对照品及供试品在549nm波长处有最大吸收，选择549nm作为检测波长。

2.3 反应时间的考察 按2.2项下方法配制反应液后摇匀，室温放置，于不同时间测定吸光度（A）。结果表明，在室温条件下，溶液的A值逐渐降低，在25min后稳定，表明反应已完全，故将反应时间定为25min。

2.4 阴性对照实验 精密量取酸性品红溶液8.0ml，共2份，分别置50ml量瓶中，各加乙酸盐缓冲液约30ml，分别加入自制不含焦亚硫酸钠的胞磷胆碱钠注射液与乙酸盐缓冲液各1.0ml，用乙酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，室温放置25min，测定在549nm处的A值。两者在549nm波长处的A值一致，故胞磷胆碱钠不干扰焦亚硫酸钠的测定，且乙酸盐缓冲液在放置0min与25min时A值一致，表明酸性品红溶液自身颜色在室温放置25min内不会逐渐减褪。

2.5 测定方法 精密量取酸性品红溶液8.0ml，置50ml量瓶中，加乙酸盐缓冲液约30ml，精密加入胞磷胆碱钠注射液1.0ml，用乙酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，室温放置25min。以乙酸盐缓冲液为空白对照，在549nm波长处测定A值。

2.6 线性范围考察 精密量取酸性品红溶液8.0ml，共8份，分别置50ml量瓶中，各加乙酸盐缓冲液约30ml，精密加入对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0ml，按2.5项下操作，测定A值。以对照品溶液A值的倒数（1／A）与其浓度（c）进行线性拟合，无水亚硫酸钠的浓度在4.44～177.6μg／ml范围内，即焦亚硫酸钠浓度在3.35～133.9μg／ml范围内，1／A与浓度c呈良好的线性关系，回归方程为1／A＝0.114 2 c＋0.301 3，r＝0.999 6。

2.7 重复性实验 取同一批供试品6份，分别测定含量，结果RSD为1.18%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取无水亚硫酸钠对照品80、100、120mg，分别置50ml量瓶中，用0.04%的EDTA－2Na溶液溶解并定容，摇匀，作为对照品溶液。精密量取酸性品红溶液8.0ml，共9份，分别置50ml量瓶中，各加乙酸盐缓冲液约30ml，分别精密加入对照品溶液0.5ml，再分别精密加入已知含量的供试品溶液0.5ml，并用乙酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，按2.5项下方法操作，求得平均加样回收率为96.4%，RSD为2.0%（n＝9）。

2.9 含量测定 照2.5项下方法测定各供试品溶液的A值。按2.6项中标准曲线定量。样品测定结果见表1。

表1 不同厂家胞磷胆碱钠注射液中焦亚硫酸钠的含量测定结果（n＝3，±s，ρB／mg·ml－1）

表1 不同厂家胞磷胆碱钠注射液中焦亚硫酸钠的含量测定结果（n＝3，±s，ρB／mg·ml－1）

企业 批号 处方量 测定值A 100309 1.5 1.384±0.001 A 100524 1.5 1.474±0.002 B 09053006 0 1.020±0.001 B 09080314 0 0.940±0.003 B 09090310 0 0.834±0.001 B 09100316 0 0.928±0.002 B 09100318 0 0.984±0.003 B 09100319 0 0.961±0.001 B 09100320 0 0.938±0.001 B 10010324 0 0.940±0.003 B 10010325 0 0.969±0.001 B 10010503 0 0.907±0.004 B 10010514 0 0.944±0.002 B 10010521 0 0.897±0.002 B 10030312 0 0.996±0.001 C 090330410 0 0 C 091120800 0 0

3 讨 论

3.1 反应原理 焦亚硫酸钠中含有两个＋4价的硫，亚硫酸钠（Na2SO3）中含有一个＋4价的硫，因此发生氧化还原反应时，2mol的亚硫酸钠相当于1mol的焦亚硫酸钠，即2.52g的亚硫酸钠相当于1.90g的焦亚硫酸钠。

3.2 测定结果分析 本研究所建立的方法可准确测定胞磷胆碱钠注射液中加入焦亚硫酸钠的含量，从而准确判断样品中是否非法添加焦亚硫酸钠。本研究通过对3个厂家17批样品进行测定，发现B厂共13批样品均未按处方量规定，擅自添加焦亚硫酸钠，存在一定安全隐患。焦亚硫酸钠极易被氧化，在生产过程中会有不同程度的损耗，故A厂2批样品测得值比处方量偏小，并可能出现一定差异。

3.3 比色反应条件 姚克荣等［3］认为焦亚硫酸钠与酸性品红溶液的显色反应条件应控制为28℃水浴15min，吴小曼等［4］认为反应温度不重要，关键是对照品溶液与供试品溶液同时平行操作，室温下放置25min。作者发现在室温下放置25～40min，A均保持稳定。因焦亚硫酸钠极易被氧化成硫酸盐，因此含量测定应在样品开封后立即取样，以减小误差。3.4 对照品的选择及配制 焦亚硫酸钠具有极易被氧化的特性，不宜作为对照品进行实验，应选择相对稳定的无水亚硫酸钠作为对照品，且配制亚硫酸钠对照品溶液时选用0.04%的EDTA－2Na溶液稀释定容，可有效防止亚硫酸钠对照品被氧化，增加测定结果的可靠性。采用标准曲线法进行含量测定，可以在一定程度上降低测定误差。

3.5 标准曲线 姚克荣等［3］认为，亚硫酸盐浓度与1／A呈线性关系，吴小曼等［4］认为按双对数方式拟合得到的标准曲线，其相关系数要优于倒数方式。作者采用两种方式进行数据处理，发现亚硫酸盐浓度与1／A的线性关系较好。

［1］ 顾复昌，杨亮懿.胞二磷胆碱的生产［J］.发酵科技通讯，2007，36（1）：9－11.

Gu FuChang，Yang LiangYi.The production of citicoline［J］.Ferment Sci Technol Commun，2007，36（1）：9－11.In Chinese.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010年版二部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：1238.

State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 2［S］.Beijing：Chinese Medical Science Press，2010：1238.In Chinese.

［3］ 姚克荣，徐连连.影响复方氨基酸注射液中焦亚硫酸钠含量测定的因素［J］.中国生化药物杂志，1997，18（3）：132－134.

Yao KeRong，Xu LianLian.Factors affecting the determination of the content of sodium pyrosulfite in complex amino acids injection［J］.Chin J Biochem Pharm，1997，18（3）：132－134.In Chinese with English abstract.

［4］ 吴小曼，纪 宇.比色法测定复方氨基酸注射液（18AA－Ⅰ）中焦亚硫酸钠的含量［J］.中国药品标准，2007，8（5）：38－40.

Wu XiaoMan，Ji Yu.Content determination of sodium pyrosulfite in compound amino acid injection（18AA－Ⅰ）by the colorimetric method［J］.Drug Stand China，2007，8（5）：38－40.In Chinese with English abstract.