外周血循环DNA水平测定在急性心肌梗死中的临床意义

【作 者】徐运强，刘蓓，赵召霞，王桂花，朱向辉，潘世扬，陈丹

1 石家庄市第二医院检验科，石家庄市，050051

2 石家庄市第五医院检验科，石家庄市，050021

3 江苏省人民医院检验科，南京市，210029

心肌梗死是临床常见的急性多发病，是严重威胁人类健康的疾病之一，其发病率和死亡率均有逐年增加的趋势，因而倍受关注。心肌梗死属于冠心病的严重类型，是心肌缺血性坏死。循环DNA（circulating DNA）是存在于血液（血浆或血清）、滑膜液和脑脊液等体液中的细胞外DNA，其量和性质的改变在创伤、肿瘤、产前疾病等的诊断和预后判断方面具有重要意义。当发生组织器官损伤时，循环DHA水平显著升高。目前，国内尚未见到有关心肌梗死患者血浆循环DNA水平变化规律的报道。本研究选择40例急性心肌梗死患者作为研究对象，观察循环DNA水平在急性心肌梗死中的变化规律，探讨其在急性心肌梗死中的应用价值。

1 一般资料

40例急性心肌梗死患者均为2010年10月至2011年5月期间在石家庄市第二医院住院的患者，其中男性28例，女性12例，年龄45～66岁。诊断符合2001年12月中华医学会心血管病分会修订的“急性心肌梗死诊断和治疗指南”中诊断标准[1]，排除合并急慢性感染、肿瘤、手术、创伤和免疫性疾病，且无其他严重心脑血管和肝肾功能病变。同期选择40例在石家庄市第二医院体检的健康人作为对照组，其中男性22例，女性18例，年龄40～60岁。两组性别、年龄均无统计学意义，P＞0.05。

2 方法

2.1 血浆标本的采集和保存

采集健康体检者和急性心肌梗死患者发病后48小时内和治疗后（约8周）恢复期静脉血各2 ml，EDTA抗凝，3000 rpm/min离心10 min，吸取上清液1.5 ml离心管中，16 000 rpm/min离心10 min；吸取上层无细胞血浆200 ml，置于含有5.0×104拷贝重组质粒0.2 ml离心管（江苏省人民医院潘世扬教授馈赠）中，充分混匀后-20℃保存备用。

2.2 血浆循环DNA的提取

采用磁珠法同步提取血浆DNA和重组质粒。试剂盒由上海浩源生物技术有限公司提供。

2.3 荧光定量PCR检测血浆循环DNA

采用双重荧光定量PCR技术检测提取的血浆DNA和重组质粒，检测方法参见文献[1]。试剂盒由江苏省人民医院潘世扬教授馈赠。

2.4 心肌酶的检测

采用雅培C8000全自动生化分析仪检测心肌酶谱，包括天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）、肌酸激酶（CK）及肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）和肌钙蛋白T（cTnT）。

2.5 统计学方法

应用SPSS13.0统计学软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用成组设计t检验，相关性采用直线相关分析， P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 健康对照组与心肌梗死患者治疗前血浆循环DNA和心肌酶谱水平的比较

健康对照组、心肌梗死患者治疗前循环DNA水平分别为（21.5±10.7）ng/ml和（253.6±45.7）ng/ml，后者显著高于前者(P=0.000)。心肌梗死患者血清AST、LDH、α-HBDH、CK、CK-MB和cTnT水平均显著高于对照组，见表1。

表1 健康对照组和心肌梗死患者治疗前后血浆循环DNA及心肌酶水平的变化Tab.1 Changes of plasma circulating DNA and myocardial enzyme spectrum in patients with acute myocardialinfarction and control group before and after treatment.

3.2 心肌梗死患者治疗前后血浆循环DNA和心肌酶谱水平的变化

心肌梗死患者治疗后血浆循环DNA显著下降(P=0.000)；治疗后AST、LDH、α-HBDH、CK、CK-MB和cTnT水平均显著降低，P值均小于0.05，见表1。

3.3 相关性分析

通过Pearson相关性分析发现循环DNA与CKMB、cTnT呈正相关，r值分别为0.613和0.654，P值分别为0.032和0.021。

4 讨论

心肌梗死是指急性、持续性缺血、缺氧（冠状动脉功能不全）所引起的心肌坏死，临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴白细胞增高、发热、血沉加快，血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭等合并症，常可危及生命。急性心肌梗死的临床诊断常常依赖心电图和病史，但单一心电图检查存在不足，心电图诊断急性心肌梗死的阳性率至多81%，其余的20%必须依靠实验室的标志物检测进行确诊。目前应用最多的血清标志物为传统的心肌酶谱和肌钙蛋白检测。研究结果显示急性心肌梗死患者心肌酶谱（包括AST、LDH、α-HBDH、CK和CKMB）和cTnT水平均显著高于健康对照组，且治疗后水平显著降低，与治疗前相比差异具有显著意义。cTn（cTnT和cTnI）是目前诊断心肌损伤尤其是心肌梗死灵敏度和特异性最好的生物化学标志物，其灵敏度（6～12）h可达100%，特异性可达74%～98%。虽然心肌酶对心肌梗死的诊断敏感性和特异性均不如心肌蛋白，但cTnT和cTnI与肌酸激酶及其同工酶（CK、CK-MB）组合对于心肌梗死诊断是很灵敏和很有特异的指标。

循环DNA是一种无细胞状态的细胞外DNA，存在于血液、滑膜液等体液中，主要由单链或双链DNA以及单链与双链DNA混合物组成[2]。大量研究证实，健康人和许多疾病患者血清和血浆中都含有一定量的循环DNA，主要来源于组织细胞死亡后释放的DNA片段，还有部分来源于肿瘤细胞分泌的DNA片段[3－4]。游离循环DNA的检测除了用于研究肿瘤学和胚胎医学外，也被有效地应用在对其他疾病的研究中，这些疾病包括外伤、中风、糖尿病和自身免疫性疾病等[5]。本研究结果显示，患者发生急性心肌梗死时循环DNA水平显著升高，与健康对照组相比差异具有显著意义(P=0.000)，而且治疗后其水平显著下降，治疗前后相比差异也具有显著意义(P=0.000)，说明外周循环DNA水平与心肌的损伤和修复密切相关。

急性心肌梗死患者循环DNA水平与CK-MB、cTnT呈正相关，r值分别为0.513和0.654，P值分别为0.032和0.021。这一结果也与Chang[6]等人研究结果一致，进一步证实外周循环DNA水平与心肌的损伤和修复的相关性。由于循环DNA升高的幅度均显著高于CK-MB和cTnT，因此循环DNA水平可以作为一种无创、快速、敏感反映心肌细胞损伤的检测指标，检测急性心肌梗死患者外周循环DNA对于心肌损伤早期诊断，监测治疗效果以及判断预后等方面都具有重要的临床意义。今后，有必要进一步研究外周循环DNA在诊断急性心肌梗死的临床价值，以确定急性心肌梗死的诊断临界值以及与梗死面积大小的关系等。

[1] 中华医学会心血管病分会. 急性心肌梗死诊断和治疗指南[J]. 中华心血管病杂志, 2001, 29(12): 705—720．

[2] 潘世扬, 王俊宏. 循环DNA的临床应用研究进展[J]. 齐鲁医学检验, 2004, 15(3): 1-2.

[3] Swarup V, Rajeswari MR. Circulating (cell-free) nucleic acids-A promising, non-invasive tool for early detection of several human diseases[J]. FEBS Letters 581(2007): 795-799.

[4] Holdenrieder S, Stieber P. Clinical use of circulating nucleosomes[J]. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences,2009, 46(1): 1-24.

[5] 胡影, 倪虹. 人体游离循环DNA 的研究进展[J]. 遗传, 2008,30(7): 815―820.

[6] Chang CP, Christine P.Y., Rhu-Hsin, et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction[J]. Clinical Chimical. Acta, 2003, 327(1-2): 95–101.